瓊脂糖凝膠電泳實驗原理和實驗方法

[實驗原理]

電泳是現在用于分離和純化DNA片段的最常用技術。當裝備一塊“膠”即包含電解質的多孔支持介質并把它置于靜電場中，DNA分子將向陽極移動，這是因為DNA分子沿其雙螺旋骨架兩側帶有含負電荷的磷酸根殘基。當DNA長度增加時，來自電場的驅動力和來自凝膠的阻力之間的比率就會降低，不同長度的DNA片段就會表現出不同的遷移率。因而就可依據DNA分子的大小來使其分離。該過程可能通過把示蹤染料或分子量標準參照物和樣品一起進行電泳而得到檢測。分子量標準參照物也可以提供一個用于確定DNA片段大小的標準。

依據制備凝膠的材料，凝膠電泳可被分成兩個亞類：瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳。相比之下，瓊脂糖凝膠在分離度上比聚丙烯酰胺凝膠電泳差一些，而在分離范圍上優于聚丙烯酰胺。一般，瓊脂糖凝膠適用于分離大小在0.2-50Kb范圍內的DNA片段。

【應用】分離、純化和鑒定0.2-50Kb的DNA片段

[實驗用品]

1. 瓊脂糖（1.0%）

1.0g瓊脂糖+100ml電泳緩沖液，微波爐中火30秒至沸騰，熔化的瓊脂物冷卻至60℃時（可加入10mg/ml溴化乙錠2.5μl，充分混勻），將溫熱的凝膠倒入已置好梳子的膠膜中，在室溫下放置30-45min后現進行電泳。1.5%:瓊脂糖1.5g。

2.電泳緩沖液：

50×TAE（Tris－乙酸） Tris 242g（終2 mol/L）

乙酸 57.1ml （終1mol/L）

0.5M EDTA200ml（pH8.0，終100mmol/L）

dH2O 補足至1000ml

使用時稀釋1×TAE。

5×TBE（Tris－硼酸） Tris 54g （終445mmol/L）

硼酸 27.5g （終445mmol/L）

0.5M EDTA20ml（pH8.0，終10mmol/L）

dH2O 補足至1000ml

使用時稀釋10倍成0.5倍，如50ml貯存液+450ml水→500ml工作液。

[實驗內容與方法]

1. 移取適量的瓊脂糖(如制備1%的瓊脂糖膠液，就移1g的瓊脂糖溶于100ml TAE緩沖液中)微波爐加熱使其溶于TAE緩沖液中。

2.緩慢地將瓊脂糖膠液注入一個帶有“梳子”的膠床中(避免氣泡產生)，若有氣泡產生用塑料移液管移去。現在許多種膠床都可方便買到并且根據其說明書而得以應用。

3.根據膠的大小讓膠凝固20-60min.

4.當膠正凝固時，準備DNA樣品并取適量的DNA（如5μl）加1μl加樣緩沖液混合，加樣液中包含染料如溴酚藍（BPB）。

5.膠凝之后，輕輕移去梳子。將膠床放在電泳槽內，加樣孔一側靠近陰極（黑末端），注入適量的TAE緩沖液，通常緩沖液高于膠面1cm。

或加溴化乙錠（EB） 至TAE緩沖液中并使之混勻（EB的終濃度是1μg/ml）。EB也可加到膠中，即將瓊脂糖在微波爐加熱，然后冷卻至50℃，再加入EB。

6.加DNA樣品及進行電泳：

使吸管與加樣孔垂直，使吸管尖端剛好在加樣孔開口之下，緩慢將DNA樣品加入加樣孔中

7.加樣完畢后，正確連接電泳槽和電源（黑的連陰極，紅的連陽極）在打開電源之前，設定好電壓和時間（電壓100mV, 時間30min.）

8.通過檢查加樣孔附近的鉑線來檢測接線柱是否連接良好。若連接良好　，負極附近的鉑絲會有氣泡產生。

9.電泳過程要進行一個合適的霎時間。電泳時間的選擇取決于膠的長度和電壓的大小。膠越長，電壓越低，所需時間越長、然而，使用高電壓時，大的DNA片段的分辨率很低。

10.凝膠攝影

[注意事項]

1. TAE和TBE都是常用的緩沖液，TBE相對于TAE而言有較高的緩沖量。

2.電泳中，溴酚藍和0.5Kb大小的DNA一起移動，這可給泳動最快的DNA片段提供一個指征。

3.DNA的遷移依賴如下因素：

DNA分子越小，遷移越快。瓊脂糖其濃度越低，遷移越快。DNA的構象，環狀切口DNA比線狀DNA遷移快。兩電極間每厘米的電壓。電壓越高，遷移越快。

4.引物：1個OD260值相當于33μg,2個OD260值相當于66μg

引物的貯存液濃度為100μmol.L-1 ；工作液濃度為20μmol.L-1

故2個OD260值的引物稀釋為100μmol.L-1的工作液時所需的加水量：

（66μg/分子量）×104＝所需加水的μl數.一般PCR反應中的引物終濃度為0.2~1.0μmol.L-1.

Xmol.L-1=OD260/[A(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600)]

A、G、G、T（引物中的個數）

5.RNA定量:根據OD260值算出 OD260＝1　的溶液其RNA含量約為40μg/ml

6.dNTP一般反應中每種dNTP的終濃度為20~200μmol.L-1。理論上4種dNTP各20μmol.L-1足以在100μl反應中合成2.6μg的DNA，dNTP可配成5－10mmol.L-1并分裝，－20℃貯存。