生態中心在同源重組分子機制研究方面取得進展

　　近日，中國科學院生態環境研究中心研究員汪海林團隊在同源重組分子機制研究方面取得進展，相關研究成果以Flanking strand separation activity of RecA nucleoprotein filaments in DNA strand exchange reactions為題在線發表于Nucleic Acids Research。

　　同源重組是一種十分保守的生物學機制，主要參與DNA雙鏈斷裂的準確修復和減數分裂過程中的非等位基因重組，在維持基因組穩定性和促進遺傳多樣性等方面發揮關鍵作用。同時，多種環境污染物可引起最為嚴重DNA損傷（雙鏈斷裂），產生遺傳毒性。而同源重組修復可有效消除這類遺傳毒性。同源重組步驟繁多，需要多種蛋白質機器的協同參與，并受到精細調控。RecA/Rad51家族蛋白在單鏈DNA上組裝形成的核蛋白纖維絲（nucleoprotein filament）具有同源尋找和識別功能，其介導的與同源雙鏈DNA之間的鏈交換過程是同源重組的核心步驟，對其分子機制的解析是該領域的研究熱點和難點。在前期研究工作中，汪海林團隊通過發展新穎的分析方法（包括毛細管電泳-激光誘導熒光偏振、酶切保護介導的單DNA片段分子測序等）可解析RecA蛋白在單鏈DNA上的動態組裝。研究表明，在生理條件下（即存在有效的ATP水解），RecA在單鏈DNA組裝形成低密度、不飽和的核蛋白纖維絲結構，含有大量裸露（未結合RecA蛋白）的核苷酸位點。經典模型中，RecA全覆蓋的ssDNA形成的核蛋白纖維絲才能進DNA鏈交換。因此，他們的這一發現是對過去經典模型的顛覆。同時研究人員提出了新的科學問題：核蛋白纖維絲結構中RecA-缺失區域是如何進行鏈交換的？為了回答這一問題，需要對鏈交換這一過程進行精細測量。然而，由于RecA蛋白介導的鏈交換反應非常迅速，對其動態過程進行高分辨解析非常困難。針對這一難題，該團隊將鏈交換核心過程進行有效“分解”，即雙鏈的分離和新堿基配對的形成兩個步驟。同時通過設計一系列非常規的DNA底物以及發展雙色交替激發-單分子熒光成像技術在單分子水平對這兩個關鍵步驟進行實時觀察，研究不飽和組裝RecA核蛋白纖維絲介導DNA鏈交換的分子機制。

　　該團隊利用截短的單鏈DNA作為入侵鏈，發現其仍能與全長的供體雙鏈DNA進行有效的鏈交換反應，表明供體雙鏈上“多出”的DNA片段在此過程中也發生了雙鏈解旋。由于缺少對應的入侵鏈，這一“多出”的部分不能被RecA蛋白直接接觸，研究人員將這種不依賴RecA直接接觸的解旋作用命名為RecA核蛋白纖維絲的側翼鏈分離活性，并進一步利用兩端同時延長的供體雙鏈作為底物，對側翼鏈分離所需的能量進行了評估。在此基礎上，他們通過將1-3個不具有RecA成核能力的短片段（15個堿基長度）與較長的DNA片段（48-78個堿基長度）進行化學串聯，構建了一種新的入侵鏈底物進行鏈交換反應。在ATP水解條件下，這些短片段不能被RecA結合，也不能與其對應的同源雙鏈DNA發生鏈交換，但仍然具備堿基配對能力，因此能夠用于模擬不飽和組裝核蛋白纖維絲上未被RecA結合的裸露核苷酸位點。實驗結果顯示，相比于截短的入侵鏈，偶聯有短片段的入侵鏈具有更高的鏈交換能力，表明這些短片段的堿基配對能力能夠促進側翼鏈雙鏈分離活性，使其達到一個較長的范圍（>45個堿基長度），揭示了長程側翼鏈雙鏈分離活性的存在。他們利用雙色交替激發-單分子熒光成像技術對不同底物之間的鏈交換過程進行了實時觀測并比較了它們的反應動力學，發現側翼鏈分離是鏈交換反應的限速步驟，而入侵鏈與互補鏈的堿基配對可以通過降低能量壁壘加速這一過程。

　　基于上述實驗結果，研究人員提出了一種側翼鏈分離依賴的DNA鏈交換模型，揭示了不飽和組裝RecA核蛋白纖維絲介導DNA鏈交換的分子機制。這一發現為深入理解同源重組及相關生物過程提供了新的方向。

　　相關研究工作得到國家自然科學基金的資助。