生物樣品分析ISR及ISR失敗原因淺析

生物樣品的特點是成分比較復雜，包括基質、內源性物質和代謝產物等，而待測物的含量卻很低（pg~μg級水平），這對分析方法提出了很高的要求，分析方法需要通過驗證才能用于實際樣品的檢測，而生物樣品分析方法驗證的主要指標之一是方法的重現性，試驗樣品再分析（incurred sample reanalysis，ISR）是指用驗證過的分析方法對試驗樣品進行再次分析。ISR是用于評價分析方法重現性最直觀和有效的手段，用于方法驗證的標準曲線樣品和質控樣品都是加樣樣品，將已知濃度標準溶液加入空白基質中配制而成，并不能完全模擬實際樣品。由于蛋白結合，代謝物轉化、樣品均一性等情況都可能影響試驗樣品在已經驗證過的分析方法檢測結果出現大的偏差。所以通過ISR來驗證生物樣本分析方法的重現性非常必要。

2015版藥典9012生物樣品定量分析指導原則對于ISR也作了說明和相關的要求。必須進行ISR的實驗是：毒動學實驗，每個物種需要一次、所有關鍵性的生物等效實驗、首次用于人體的藥物試驗、首次用于患者的藥物試驗、首次用于肝或腎功能不全患者的藥物試驗；數量是一般應重復分析10%的樣品，如果樣品總數超過1000，超出部分重新分析5%樣品；建議選取獲得C_max附近和消除相樣品進行再次分析；對于再分析的樣品結果至少67%和首次測定的結果的偏差不超過20%。

報道的ISR失敗率在5%左右，雖然ISR的失敗率很低，但一旦失敗，樣品測定結果的準確性和重現性都會被質疑，甚至需要修改分析方法進行再確證。這一系列的工作都會消耗極大的人力和時間，本文簡單介紹下可能造成ISR失敗的原因，為分析方法開發和ISR失敗原因調查提供參考。

一．人為因素

雖然人為因素造成的ISR失敗是最不該出現的，但由于分析人員缺乏經驗或者非主觀故意的失誤也會造成ISR失敗，如樣品貼錯標簽、位置擺放錯誤，樣品處理前為完全融化，樣品污染等等都會造成ISR失敗。

二．藥物不穩定

藥物不穩定或者在生物基質中不穩定是很容易造成ISR失敗的原因，這需要在方法建立的時候進行全面的考察，標準溶液、處理后樣品、質控樣品的穩定性經過考察后，處理樣品應該嚴格按照考察穩定的條件下儲存、轉運、處理和分析樣品。

還有一種情況是實際樣品可能含有待測物的代謝產物，而方法確證樣品是不含代謝產物的。實際樣品中可能會有待測物和代謝產物相互轉化的情況，或者代謝產物干擾待測物的檢測的情況，文獻報道的LC-MS/MS方法測定人血漿中依西美坦ISR-1失敗，推測是前處理過程影響樣品的穩定性，冰浴條件下進行樣品前處理，ISR-2依然失敗，分析原因發現，依西美坦與其血漿中的代謝產物存在可逆反應，室溫條件下會互相轉化，改變處理條件，使用液液萃取，前處理溶液和萃取劑都經過預冷且在冰浴下進行樣品萃取，可以抑制代謝產物轉化成待測物。因此方法開發過程中需要考慮代謝產物是否會轉化成原藥的問題。

三．樣品前處理未嚴格按照確證方法進行

進行樣品前處理的時候有可能會由于一些小的細節沒有把握好造成測定結果的差異，例如渦旋震蕩器進行樣品混合提取時，由于有些渦旋震蕩器的效力不是均勻的，會有部分樣品提取的時候渦旋不充分，導致提取回收率低，而有些提取太充分導致一些干擾成分提取出來，影響了檢測結果。還有一些是移液過程中使用的移液器不適合轉移有機溶劑，導致移取的提取液體積不準，影響提取效率。

四．分析方法本身缺陷

分析方法本身缺陷導致的ISR失敗，主要的有以下的方面：

1.      
基質效應

如果分析方法的基質效應比較大，基質效應會隨著樣品濃度的改變而不同，或者未考慮特殊基質（如溶血和高血脂）的影響，或者內標和待測物的基質效應影響不同，內標響應的變化對ISR數據影響非常大。

2.      
不同的蛋白結合率

由于有些藥物和蛋白的結合程度不同，有些待測物在試驗樣品和方法確證樣品中不同的回收率，如文獻報道的硼替佐米與紅細胞結合，硼替佐米提取回收率在試驗樣品和方法驗證樣品有10倍之多的差異，可能是硼替佐米與蛋白結合的過程是緩慢的或者體外情況下不容易結合。如果方法建立時沒有考慮到這一點，就很容易導致了檢測結果很難重現，ISR結果失敗。

3.      
分析方法的粗放度

有些分析方法在方法確證都可以通過，但實際樣品時ISR不容易通過，如文獻報道的氯吡格雷的生物樣品分析方法，氯吡格雷的解離常數pKa為4.3，為了獲得較好的提取回收率，提取過程中加入了PH3的緩沖液，但ISR失敗，分析原因時發現確證樣品不受影響，但實際樣品經過酸性緩沖液的處理后，再測值和原值存在顯著差異，改成PH為6的緩沖液后，ISR通過。

總而言之，避免ISR失敗需要在方法建立時，需要對待測物的理化性質進行足夠的了解，對基質對待測物的影響，以及待測物在基質的穩定性、提取過程的穩定性都需要全面考察；同時應避免一些人為因素導致結果測定的不準確。