生物樣品的自動前處理

圖1.  Co-Sense for BA系統基本配置圖。

在血漿、血清和尿樣等生物樣品的分析中，在前處理中去除蛋白和其它基地物質等大分子的干擾，對于目標小分子藥品的分析是非常重要的。本文介紹了一種有效的在線預處理柱，實驗表明效果良好。

Co-Sense for BA系統利用獨特的“Shim-packMAYI 系列”樣品預處理柱，實現生物樣品的自動前處理，獲得更好的重現性。

高靈敏、高選擇性的LC/MS技術是進行藥物代謝動力學、臨床和代謝產物研究的有力手段。血漿、血清和尿樣這類生物樣品，在LC/MS進樣前通常進行前處理以盡可能地減小蛋白和其他基底物質對分析的影響。最近，開發出幾種限制性通路媒介Restricted Access Media（RAM）柱，用于生物樣品的在線前處理。已見報道的用于自動樣品預處理柱還包括內表面反相柱，混合功能硅膠柱，半透表面硅膠柱，二醇硅膠柱等。

甲基纖維素涂覆固定的反相前處理柱MC-ODS（Shim-pack  MAYI-ODS），使用甲基纖維素修飾多孔硅膠，并將其內表面以ODS修飾。

圖2.  使用不同導入液，血漿中添加藥物的回收率（添加濃度為0.5μg/ml，進樣體積：50μl）。

外表面涂覆的甲基纖維素可防止蛋白質的吸附，而小分子通過與ODS基團間的疏水作用被內表面保留。Shim-pack MAYI-ODS柱連同柱切換技術一起，可以實現血漿等生物樣品的直接進樣。而反相RAM柱對極性化合物保留較弱。由子保留機制為疏水作用，這就會降低極性化合物的回收率。MC-SCX（Shim-pack MAYI-SCX）柱和Shim-pack MAYI-SAX柱的孔中含有離子交換基團，可以成功地用于血漿中親水性化合物的分析。

Shim-pack MAYI系列色譜柱是用于生物樣品捕集和濃縮分析的HPLC在線預處理柱，填料為全多孔高純度球形硅膠。硅膠外表面涂覆甲基纖維素聚合物，孔內化學鍵合固定相如C18等。MAYI系列色譜柱具有多種固定相可供選擇。

蛋白質等生物分子通過體積排阻效應被MAYI柱去除，而小分子的目標化合物可以進入孔內，并基于疏水作用被柱保留。在柱切換系統中使用MAYI預處理柱，蛋白分子被自動去除，繼而可對目標小分子化合物進行分析。自動樣品除蛋白和目標化臺物分析完美地結合起來。

圖3.  血漿中5種藥物的SIM色譜圖：A為標樣，B為血漿添加樣。

系統配置

圖1為Co-Sense for BA系統典型的配置。自動進樣器進樣，樣品由C泵帶入MAYI柱。MAYI柱捕集、富集目標分析物，同時蛋白質被去除。除蛋白操作結束后，通過閥切換，保留在MAYI柱的目標分析物被反沖入分析柱，繼而被分離和相應的檢測器檢測（UV、MS、MS/MS等）。

對于Co-Sense for BA系統，為了樣品分析更有效，使用C泵的溶劑切換閥并添加D泵引入稀釋液。利用溶劑切換閥，可以使用C2（C3或C4）溶劑沖洗前處理流路，減少交叉污染。稀釋泵可加快蛋白和分析物之間的分離，提高回收率。

圖4.  5種藥物的定量標準曲線。進樣為10ml大鼠血漿添加樣。

MAYI-ODS柱的方法建立

除蛋白

MAYI柱除蛋白所需時間與柱尺寸、流速、稀釋倍數和溶劑種類等因素相關。蛋白從MAYI柱清除完成前，不進行閥切換。這樣可以避免分析柱、系統管路的堵塞。蛋白從MAYI柱的洗脫情況通過紫外260nm監測。血漿樣品進樣后，蛋白吸收降為1mAbs所需時間見表1。其中，稀釋倍數為8（C泵流速/D泵流速=1/7），溶劑為10nM乙酸銨/乙腈=95/5，MAYI-ODS（4.6mml.DX10mml）。

導入溶劑（預處理流動相）

樣品導入溶劑（圖1中C1流動相）將樣品送入捕集柱。生物樣品中，藥物一類的低分子量物質通常與蛋白分子結合。有時藥物分子可能在使用MAYI-ODS除蛋白的操作步驟中一起被去除，造成回收率低。

表1.  使用MAYI-ODS前處理主血漿中除蛋白所需時間

因此為獲得高回收率，可以通過優化導入溶劑，削弱蛋白與藥物分子間的結合。調節樣品導入溶劑中的離子強度和其中有機相的比例，是提高回收率的有效手段（圖2）。

通常，在樣品導入溶劑中添加10％或更低濃度的乙腈有利于提高回收率。由于血漿樣品中白蛋白的Pl，值接近4~5，所以載入溶劑的理想的pH值范圍應為2~3或6~7，以防止白蛋白在系統中沉淀，造成堵塞。使用同樣的溶劑作為分析流動相A也是節省人力的便捷方式。

此外，Co-SenseforBA系統包括一臺D泵，用于樣品的在線稀釋。樣品可被導入溶劑自動稀釋，以利于目標藥物分子從蛋白中分離。當導入溶劑不能提供足夠的回收率時，在線稀釋也是改善回收率的有效方法。稀釋用的溶劑和樣品導入溶劑（C1）相同

表2.  添加在血漿中的5種藥物分析條件

應用MAYI—ODS

MAYI柱作為在線預處理柱，使用優化的填料和涂覆技術，不僅能夠有效去除蛋白，而且顯示出長期的穩定性和寬廣的生物樣品使用范圍；Co-Sense for BA與LC/MS聯用，在6min的分析周期內完成了5種添加在血漿中的藥物分析（圖3）。

這幾個藥物在MS檢測中，以ESI正離子選擇離子模式（SIM）檢測每種藥的［M+H］離子。分析條件列于表2。

血漿樣品顯示出和標樣類似的洗脫曲線，這一分析方法表現出優異的結果和重現性。回收率和線性見表3和圖4。

表3.  檢測化合物重現性和回收率（1μg/ml，5μl）

結論

通過使用獨特的涂覆及優化的填料技術，Shim-pack MAYI系列顯示了除蛋白的前處理功能。包含MAYI前處理柱的Co-Sense for BA系統實現了血漿類生物樣品的自動前處理，由此免除了人工的前處理操作。MAYI柱適用范圍廣，耐久性好，具有不同種類的固定相。由于消除了手工樣品前處理的誤差和非持續性，該系統為定量分析提供了更高的可靠性。Co-Sense for BA系統是生物樣品的自動前處理的有力工具。