生物正交功能化聚集誘導發光材料智能識別與殺傷致病菌

　　細菌感染引起的疾病正在以不可預測的速度快速增加，對人類的生命健康造成重大威脅。目前臨床抗菌治療的主要障礙是無法對多重細菌交叉感染進行快速、準確地診斷，進而錯過最佳的治療階段。當前鑒別細菌病原體的診斷方法主要包括血液培養、組織樣本、聚合酶鏈式反應（PCR）等。但是，這些方法存在檢測時間長、精準度低、檢測流程復雜以及需要依賴精密儀器等缺點。由于無法及時可靠地獲取細菌病原體的信息，大多數細菌感染都根據醫生的經驗診斷并采用廣譜抗生素予以治療。廣譜抗生素的普遍使用往往容易導致細菌產生耐藥性。據估計，除非新的抗菌藥物研究有重大進展，否則到2050年細菌感染致死將是導致人類死亡的主要原因。因此，設計并探討可快速有效辨別和精確殺傷細菌病原體的方法具有重要意義。

　　近日，新加坡國立大學劉斌教授課題組成功開發了一種基于生物正交原理的可快速精準辨別和殺傷革蘭氏陰性、陽性細菌的功能探針TPEPA（見圖1C）。首先，通過生物代謝工程的方法可分別使得陰性菌表面的脂多糖層和陽性菌肽聚糖層富含疊氮基官能團。TPEPA是一種具有聚集誘導發光特性的光敏劑。其具有良好的水溶性，在水溶液環境中的熒光極其微弱，同時TPEPA具有可與疊氮基團進行click反應的炔基，當炔基與陰性菌（陽性菌）表面的疊氮發生click反應后，TPEPA分子內運動被抑制使得熒光被“點亮”。根據革蘭氏陰陽性菌細胞結構的不同，作者采用Kdo-N3糖和Ala-N3氨基酸分別對革蘭氏陽性菌和陰性菌進行生物代謝處理后，可以實現TPEPA對革蘭氏陽性菌和陰性菌的選擇性檢測與原位殺傷。

圖1. TPEPA鑒別并殺傷革蘭氏陰性菌和陽性菌的機理示意圖

　　首先作者選用Escherichia coli（E. coli）作為革蘭氏陰性菌的模型菌, 在經過Kdo-N3代謝處理后，分別與不同濃度的TPEPA 進行孵育 (圖1A), 流式細胞計數結果顯示E. coli的熒光強度具有濃度依賴性。臨床上使用的菌落培養法檢測細菌常常需要數天的時間，而TPEPA標記細菌的時間非常迅速。流式結果顯示只需要半小時，大部分的E. coli細菌即可以被標記上近紅外熒光（圖2A）。接著作者選用Staphylococcus aureus (S. aureus) 作為革蘭氏陽性菌的代表菌，在經過D-Ala-N3代謝處理后，S. aureus也可被快速標記上近紅外熒光。從激光共聚焦圖中可以看到，TPEPA的紅色熒光信號主要集中在E. coli和S. aureus細菌的外圍（圖2C3和2D4），而在細菌的細胞質中并沒有發現紅色熒光信號。其他革蘭氏陽性菌 （MRSA 、Bacillus subtilis）和陰性菌（Salmonella typhimurium、Pseudomonas aeruginosa）中也發現類似的現象。

圖2. 功能探針TPEPA單獨標記E. coli和S. aureus細菌能力的研究

　　接下來，作者考察了TPEPA選擇性標記混合菌中革蘭氏陰性菌和陽性菌的能力。首先作者將革蘭氏陰性菌（E. coli）和革蘭氏陽性菌（S. aureus）等比例混合得到混合細菌溶液。Kdo是革蘭氏陰性菌LPS的重要組成成分，而革蘭氏陽性菌中并沒有LPS，因此經過Kdo-N3代謝處理后的革蘭氏陰性菌可以被TPEPA選擇性地標記，而革蘭氏陽性菌并不能被標記。D-Ala可以代謝至革蘭氏陰性菌和陽性菌的肽聚糖上。但是不同于革蘭氏陽性菌，革蘭氏陰性菌最外層有一層外膜，該外膜可以阻止分子量大于650 Da的分子進入細菌外膜。功能探針TPEPA分子量為1235 Da，因此在經過D-Ala-N3代謝處理后，混合菌中的革蘭氏陽性菌可以被選擇性被標記上（圖3）。通過這樣的策略，TPEPA可以快速精準地實現對革蘭氏陰、陽性菌的鑒別。

圖3. 功能探針TPEPA選擇性標記混合細菌中E. coli或S. aureus的研究

　　TPEPA是一種具有聚集誘導發光特性的光敏劑，在光照下可以產生活性單線態氧進而有效地殺滅細菌。作者接下來研究了TPEPA對細菌的光照殺菌能力。細菌生存實驗和掃描電鏡實驗結果都證明了TPEPA可以對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌具有非常良好的光照殺菌能力（圖4）。

圖4. 功能探針TPEPA對E. coli和S. aureus的光照殺菌研究

　　總之，作者設計了一種生物相容性高且對革蘭氏陰、陽性菌具有快速選擇性成像和精確殺傷功能的探針，該探針在細菌診斷和細菌感染治療等方面顯示出巨大的應用前景。

　　該項目得到新加坡國家研究基金(R279-000-483-281、R279-000 -444-281) 和新加坡國立大學研究基金(R279-000-482-133) 的資助。

　　課題組介紹

　　近年來，新加坡國立大學劉斌教授課題組主要研究和探索先進功能材料在生物醫學和清潔能源等領域中的應用。在生物醫學方面，致力于使用具有良好生物相容性的有機材料以實現對重要生物過程的高效便捷的示蹤以及對一些疾病非侵入性的治療；在清潔能源方面，主要設計合成高效的敏化劑和催化劑，用來將太陽能轉化成簡便易用的清潔能源。其成果多次發表在國際一流期刊。

　　通訊作者簡介

　　劉斌，新加坡國立大學教授，化學與生物分子工程學院系主任，新加坡工程院院士，亞太材料科學院院士，英國皇家化學會會士。同時也是ACS Materials Letters執行主編, Advanced Materials、Advanced Functional Materials等多個雜志的編委。致力于共軛聚合物發光材料、聚集誘導發光材料等在生物醫學及能源中的應用研究，其成果多次發表在國際一流期刊，h-因子89，連續多年榮獲科睿唯安 “高被引科學家” 稱號。其多項研究成果實現產業化并創立了LuminiCell公司。