生物活性測定方法設計、建立及驗證指導原則

　　近日，國家藥典委發布“關于生物活性測定方法設計、建立及驗證指導原則標準草案的公示”的通知。

　　生物活性測定方法設計、建立及驗證指導原則草案分為 6 個板塊，分別為：1.分析目標概況；2．生物活性測定方法的設計；3. 生物活性測定方法的建立；4. 生物活性測定方法的驗證；5.生物活性測定方法的持續確認和持續維護及再驗證；6. 生物活性測定方法的變更。并附生物活性測定方法設計、建立及驗證指導原則起草說明。

　　其中第2部分-生物活性測定方法的設計，包含生物活性測定方法分類、生物活性測定方法的選擇、實驗設計的考慮要點。

生物活性測定可用于原液/原料藥和制劑的批放行檢測、穩定性評價、標準物質和其他關鍵試劑的驗證、中間體和制劑處方的控制、產品雜質和降解產物的控制、生產工藝變更支持等。對于每種不同預期用途，其分析方法的專屬性（特異性）、準確度、精密度和耐用性的要求是不同的。

　　生物活性測定在生物制品的質量控制中扮演著至關重要的角色。它不僅直接關聯到生物制品的藥效和安全性，而且對于確保生物制品的質量和一致性至關重要。以下是生物活性測定重要性的幾個關鍵點：

　　1.反映生物制品有效性：生物活性測定是反映生物制品是否具有預期生物效應的關鍵指標。它確保了生物制品在臨床使用中能夠發揮預期的治療效果。

　　2. 質量控制：生物活性測定有助于在生產過程中監控生物制品的質量，確保每一批次的產品都達到既定的標準。

　　3. 安全性評價：通過對生物活性的測定，可以評估生物制品的安全性，避免可能的不良反應或毒性。

　　4. 劑量確定：生物活性測定是確定藥物劑量的重要依據，確保藥物在臨床使用中的安全性和有效性。

　　5. 方法學驗證：對生物活性測定方法進行規范的驗證，是保障其科學性和適用性的前提。

　　6. 促進科研和開發：準確的生物活性測定方法可以推動生物制品的研發進程，加快新藥的上市速度。

　　7. 符合法規要求：生物活性測定符合藥品監管機構的法規要求，確保生物制品的合規性。

　　 8. 提高國際競爭力：準確的生物活性測定有助于提高生物制品在國際市場上的競爭力。

　　9. 促進科研成果轉化：生物活性測定為科研成果轉化為實際應用提供了可靠的數據支持。

　　10. 疾病模型研究：在疾病模型研究中，生物活性測定可以為安全性研究提供有價值的信息，尤其是在使用疾病動物模型進行毒性研究時。

　　生物活性測定是確保生物制品安全性、有效性和質量的關鍵環節，對于推動生物醫藥領域的發展具有不可替代的作用。

生物活性測定方法設計、建立及驗證指導原則

　　生物活性測定方法是利用生物受試體，包括整體動物、離體組織、器官、類器官細胞和微生物等，通過觀察藥物對這些受試體的影響來評估藥物生物活性的一類方法。此類測定方法的研究對象多為生物制品、生化藥品或中藥等。本指導原則基于科學和風險管理的理念，為生物活性測定方法的設計、建立、驗證等過程提供原則性要求，主要包括分析目標概況（analyticaltargetprofile，ATP），方法的設計、建立、驗證以及持續監測和改進等全生命周期管理的相關內容。

　　1．分析目標概況

　　建立生物活性測定方法首先要了解影響產品生物活性的關鍵質量屬性(criticalqualityattributes，CQAs)，如工藝、安全性、有效性、穩定性等，結合預期用途，確定生物活性測定方法的接受標準。該標準是測定方法建立的基礎，包含單個或多個質量屬性的測定要求，可采用適當的方法性能特性及相關性能標準來描述，如專屬性/選擇性、精密度、準確度、范圍及耐用性等，根據分析方法的預期目的和所選特定技術，性能特性及相關性能標準有所差異。方法應用要求有助于分析方法的持續監測和改進，確保現行的、修訂的或新的分析方法始終適用于預期用途，是方法生命周期管理的依據。

　　ATP 包含的基本內容有: ① 方法的預期用途， 如用于測定生物效價、生物鑒別和生物限度等。② 與待分析產品的關鍵質量屬性相關的信息和方法的檢測原理。③需報告的方法特性，特別是性能特性，如準確度、精密度、專屬性 和可報告范圍，及其相應的接受標準和理論依據等。對具有多種生物活性的產品，其每一種關鍵生物活性應當分別進行研究，根據多種活性與臨床療效相關的程度確定權重系數，并設定標準。

　　2．生物活性測定方法的設計

　　生物活性測定可用于原液/原料藥和制劑的批放行檢測、穩定性評價、標準物質和其他關鍵試劑的驗證、中間體和制劑處方的控制、產品雜質和降解產物的控制、生產工藝變更支持等。對于每種不同預期用途，其分析方法的專屬性（特異性）、準確度、精密度和耐用性的要求是不同的。必要時可開發一種或多種生物活性測定方法，對各階段產品或終產品進行質量控制。對于方法適用性的判斷要建立在科學性和統計學的基礎上，同時也需考慮可操作性和經濟實用性。

　　2.1 生物活性測定方法分類

　　生物活性測定方法根據不同的實驗系統可分為體內測定和體外測定。

　　2.1.1 體內生物活性測定方法

　　體內生物活性測定是指用實驗動物來測定產品生物學反應的檢測方法，一般通過將一系列標準物質和樣品的稀釋液給予實驗動物體內，并建立藥物濃度-劑量反應關系來估算生物活性。

　　2.1.2 體外生物活性測定方法

　　體外生物活性測定方法是指采用離體組織、器官、類器官、細胞和微生物等評估產品的生物活性。

　　離體組織、器官生物活性測定是將人類或動物的組織、器官等在實驗室中培養，通過考察其對樣品的反應來估算生物活性。通常適用于樣品對離體組織、器官等有明顯活性，且量效關系顯著的情況。涉及來自動物的活體組織或器官的生物活性測定需要類似于體內測定的過程。而細胞生物活性測定則是利用體外培養的細胞對樣品的反應性來評估產品的生物活性。這些細胞可以是來源于腫瘤的細胞系，也可是轉染受體的細胞系等。

　　2.2 生物活性測定方法的選擇

　　生物活性方法的選擇應按預先設定的 ATP，采用先進的、敏感的方法進行相關研究。首先考慮與產品臨床適應癥或藥理機制相關的生物活性測定方法，如采用其他技術和方法應提供依據。

　　原則上，應盡可能減少體內測定法的使用。當體外活性與體內活性相關聯時，體 外測定可以替代體內試驗。當體外試驗不能很好的模擬體內實驗，或存在很大差異時，仍需要用體內方法評估產品的生物活性。采用動物試驗應遵循 3R 原則和相似性原則、選擇性原則、易獲得原則。

　　定量生物活性測定方法應選擇背景較低，信噪比高的反應系統，以得到較好的可 重復劑量反應曲線。如不能滿足上述條件，可考慮生物限度方法。

　　2.3 實驗設計的考慮要點

　　在生物活性測定方法設計、建立和驗證過程中，需考慮相應的產品屬性，選擇適當的實驗模型和統計方法開展研究，以對測定方法的性能特性進行評價，例如在可報告范圍內的專屬性、準確度和精密度（包括校準模型、范圍上限和/或下限）和耐用性。采用風險評估和先驗知識，以識別可能影響方法性能的方法參數，從而提高方法的成功率，減少試驗結果偏差的風險。風險評估通常在測定方法早期階段進行。

　　不同的生物活性測定方法可采用不同的實驗設計類型。選擇統計模型首先需要考 慮的是評估試驗的響應模式。模型的選擇可以取決于分析測定數據類型，如定量或定性。如采用生物效價測定法，應按照生物檢定統計法（通則 1431）的要求進行實驗設計；根據樣品測定結果的變異性確定樣品生物效價范圍和可信限或置信區間。如采用生物限值測定法（或生物鑒定），實驗設計可考慮設樣品組、陰性對照組或陽性對照組，測定方法采用體內測定法時，應考慮設模型對照組。

　　在生物測定方法開發建立階段，實驗設計類型可多樣化，一般包括單因素設計(one factor at a time，OFAT) 和多因素設計（design of expriments，DOE）的篩選設計（如：響應曲面設計、析因設計等），其目的是找出方法的最佳實驗條件。在此階段要使得方法的準確度盡可能達到最佳(偏倚達到最小) ； 在保證準確度的基礎上，提高精密度，從而保證方法能更好地滿足其預期用途的要求。而在方法驗證階段，所采用的實驗設計，主要是選擇混合效應模型的析因設計(正交或/和嵌套) 。

　　在進行單因素或多因素實驗和/或建模時，應探索已確定的測定方法參數的范圍和相互作用。擬定生物活性測定方法控制策略，包括相關分析方法參數的設定值和/或范圍。

　　2.3.1 試驗系選擇

　　試驗系的選擇與藥物作用、實驗原理和觀察指標密切相關。具體試驗系的選擇詳見3.2試驗系的選擇。

　　2.3.2 標準物質的選擇

　　標準物質的制備、標定和保存等過程應符合國家標準物質制備和標定的相關要求。標準物質的選擇應考慮如下幾個方面。

　　（1）原料的選擇是制備標準物質的關鍵。標準物質的選擇原則上應可溯源，選擇已證明足夠穩定且適合臨床試驗的一個批次或多個批次，或用一個具有代表性的原料批次作為標準物質，并應經全面的質量確證。

　　（2）標準物質原則上應與產品同質。一般選擇含組分及配比與產品（如原料/原液或制劑）所含組分和配比相似，即產品與標準物質在化學組成和/或生物效應方面應是同質的。

　　（3）通常首批新建標準物質的標定需要超出常規檢測的次數，且一般要求至少 3個實驗室進行協作標定，以確保新標準物質效價測量準確性。

　　（4）更換生物活性標準物質時，應進行標準物質原批次與替換批次的相關性研究，并對替換批次標準物質活性和含量進行標定，保證賦值的可溯源性。

　　（5）應選擇適當貯存條件以保證標準物質足夠穩定，即標準物質的保存條件在其有效期內必須能夠確保其生物活性。一般生物活性標準物質的儲存條件應比相應的藥物原料和成品更加嚴格，因此標準物質儲存條件與藥物原料和成品可能不同。例如生物制品參考品往往采用-70℃條件下進行保存。對新建標準物質應進行穩定性考察或質量監測，并進行趨勢分析。需開展不同溫度（如-20℃、4℃、25℃）等條件下的加速穩定性研究，用于評估標準物質的降解速率，以及描述其穩定性特征。為了保證標準物質的穩定性，其配方與成品也可能不同（例如，凍干配方中加入特定的穩定劑）。應考慮不同標準物質生物活性反應一致性。如在臨床前研究階段與臨床研究階段，標準物質的配方可能不同，有必要驗證其生物活性反應一致性。

　　2.3.3 樣本代表性和樣本量

　　在生物活性測定方法開發階段，為了評價生物活性模型的專屬性、準確度和耐用性。樣品通常可采用實驗室研發和中試規模產品，以提供足夠的變異度，也可采用經酸堿破壞、高溫、光照等影響因素處置的試驗樣品。建立生物活性定量分析校正模型所需的樣本數量取決于樣本基質的復雜性和/或基質對目標分析物信號的干擾，因此復雜的樣本基質通常需要更多樣本。足夠的樣本數有助于識別生物活性測定方法的變異度。

　　2.3.4 試驗條件的優化

　　生物活性測定試驗條件的優化目的是獲得最佳檢測方法，以便進行生物效價、生物限值計算時具有較好的準確度、精確度和耐用性。優化試驗通過控制實驗變化因素的條件和水平得到相對可控的結果，利用統計學手段來確定可靠和穩定的實驗變化因素。試驗條件的優化一般有兩種研究方法：單因素設計和多因素設計，前者通過逐一研究各因素而確定理想的實驗條件，后者通過同時對多因素研究而確定理想的實驗條件。通常使用多因素實驗設計可更有效的進行試驗條件的優化。相較于 OFAT, DOE 通常所需的實驗量較少，且有助于深入了解生物活性測定性能因素間的相互作用，通常包括風險分析、篩選、響應優化、確認等步驟。詳見 3.4.1 實驗參數的確定。

　　生物活性多因素模型的選擇應基于測定方法要求和所選的測定技術。模型開發之前，基于先驗知識，確定模型的性能因素，包括基礎模型假設和期望的模型適用范圍。 初始風險評估有助于了解物料和工藝中可能影響模型性能的潛在變異來源，因此應在模型校正過程中予以考慮。常規分析通常應包括使用離群值判斷對每次測定的適用性進行監測。如果確認測試或離群值判斷未能滿足預定義標準，或數據趨勢表明模型、工藝或被測物料存在潛在不可接受的性能，則需考慮對模型重新進行評估。

　　2.3.5 統計分析方法的考慮

　　生物活性測定方法應采用適宜的統計模型對相應數據分析做出判斷，包括進行數 據轉換和/或數據加權，以及建立試驗系和樣品的適用性標準。該數據分析應包括可用于異常檢測和全模型擬合的設計因素，還應包括用于選擇數據子集的計劃。一般生物效價模型應考慮：

　　（1）選擇適當的統計模型。

　　在選擇最合適的統計模型時需要考慮以下問題。首先，該模型應該適合測定終點類型---連續，計數或二分法。其次，該模型應該包括測定設計的結構。對于任何非完全隨機設計，模型中應有用于影響試驗系的因素。如細胞法的板內區組，動物設施內飼養籠的位置，給藥時間等。第三個考慮適用于連續節點，涉及是否使用回歸模型或均值模型（方差模型擬合分析適合于各樣品的各稀釋水平的單獨的平均測試），以及適當的誤差項。均值模型可能是適合的，因為它不對濃度–響應曲線進行假設。

　　（2）假設

　　在不進行平行統計模型假設的情況下，將所選統計模型與數據進行擬合，然后再評估殘差的分布，具體檢查殘差是否偏離正態和常數方差。根據需要轉換數據，或者選擇一個權重方案。盡可能使用來源于獨立檢測的實驗數據，主要目的是解決測定中的正態偏離和濃度范圍內的反應常數方差。轉換和評估殘差的分布可以交替進行。

　　（3）離群值的判斷和剔除

　　在同一劑量組內的各個反應值中，如果出現特大或特小反應值時，最終導致殘差不可用，在此情況下應進行離群值檢驗，以確定其是否應被剔除。離群值的檢驗方法很多，可參照生物檢定統計法（通則 1431）異常值剔除和缺項補足相關內容進行。應該建立用于離群值檢驗的策略，包括建立離群值可接受的范圍。

　　離群值檢驗需對每次測定的適當性進行監測。如果確認測試或離群值判斷未能滿 足預定義標準，或數據趨勢表明模型、工藝或被測物料存在潛在不可接受的性能，則需考慮對模型重新進行評估。

　　（4）模型建立和維護

　　模型假設應借助各種適宜的生物統計工具進行判斷。常采用的統計學工具包括： 殘差檢驗，用于確定數據的未建模特征（例如，x-殘差或 F-概率）。根據離群值檢驗，用于確定數據是否在模型構建的范圍內。可采用經驗證的軟件包進行模型預測。

　　2.3.6 可靠性測驗（適用性評價）

　　為確保生物活性測定方法的可靠性，應進行測定方法可靠性測驗。可靠性測驗要求在實驗所用的劑量范圍內，劑量或對數劑量的反應（或反應的函數）符合特定模型要求，且標準品與供試品的線性滿足計算原理的要求，即滿足系統適用性和樣品適用性要求，方可按有關公式計算供試品的效價和可信限。系統適用性參數可根據實驗設計和統計模型選擇，檢測系統適用性的兩個常用的方法是模型擬合優度和精密度。包括預先指定的接受標準，根據這些標準來評估一項測定（或可能包含多項測定）的有效性。系統適用性評價參數及其范圍的設定，可以根據經驗或通過參數變化對效能影響的模擬實驗確定。

　　樣品適用性檢測，是使用預先設定的標準評價樣品測試效價的可靠性，通常采用相似性評價方法。相似性評價可采用差異性或等效性檢驗統計分析方法，等效性可接受范圍或限值應視具體情況制定。應在生物活性測定方法開發和驗證之前建立系統和樣品適用性標準。在早期開發階段，適用性標準可根據生物活性測定經驗的積累不斷調整。

　　可靠性測驗可參照生物檢定統計法（通則 1431）有關模型項下可靠性測驗進行。

　　2.3.7 耐用性

　　生物活性測定方法的耐用性用于衡量正常使用期間滿足預期性能標準的能力。耐用性通過有意改變分析方法參數來測試，如樣品制備液、細胞代次、濃度、培養時間、藥物濃度、關鍵試劑的穩定性等。在耐用性研究期間，先驗知識和風險評估可為研究參數的選擇提供參考。應研究那些在使用期間可能影響分析方法性能的參數。耐用性評價通常是在方法開發期間進行的。對于固有參數變異性較高的生物活性測定方法，在耐用性研究期間可能需要研究更寬的參數范圍。

　　 3. 生物活性測定方法的建立

　　生物活性測定方法通常會涉及生物受試體的使用，因此有別于理化分析方法，通常具有更大的變異性，且其測定結果很大程度上依賴于所采用的具體方法。因此，在生物活性測定方法的建立過程中需進行全面考量。

　　3.1 實驗變異的控制

　　由于生物活性測定方法通常具有高變異性的特點，因此應盡可能采用適宜的實驗設計來減小生物變異對實驗結果的影響。在方法建立時，可根據其具體特點采用不同的方式控制生物變異大小，盡量識別或控制變異的來源：整體或離體組織、器官實驗因涉及實驗動物，應使用符合國家標準相關要求的實驗動物，來源背景清楚，飼養環境（溫濕度、光照、微生物等）、飼料、水源、運輸等條件必須可控、穩定、且可標準化。飼養環境的記錄和檢測結果的歷史數據可用于分析干擾試驗結果的影響因素；基于細胞水平的實驗則應選擇來源確定，且標準化的細胞株。

　　根據不同的測定方法采用合適的試驗設計類型也有助于控制實驗變異，如濃度與響應符合量反應平行線測定模型時，實驗設計類型可選擇采用隨機設計、隨機區組設計、交叉設計、拉丁方設計等。對影響實驗誤差的條件和因素，在實驗設計時應盡可能進行因級限制，將選擇的因級隨機分配至各劑量組。

　　3.2 試驗系的選擇

　　3.2.1 基于體內、離體組織和器官的生物活性測定方法

　　此類方法所用的試驗系為大多涉及實驗動物的使用，其結果往往與臨床效應更貼近。試驗系的選擇與實驗原理和制定指標密切相關，應選擇背景資料清楚、影響因素少、檢測指標靈敏和成本低廉的試驗系統。應盡可能研究各種因素對試驗系的影響，采取必要的措施對影響因素進行控制。整體動物實驗盡可能使用小鼠和大鼠等易于獲取，成本較低的實驗動物，并說明其種屬、品系、性別和年齡。體外實驗則選擇靈敏度高、穩定性好的離體組織、器官。離體組織、器官一般應來源于至少 3 個供體。

　　 3.2.2 基于細胞的生物活性測定方法

　　基于細胞的生物活性測定方法建立時首先要選擇適宜的細胞系。細胞系既可來源于腫瘤組織，也可為因子依賴型的永生化細胞系，經修飾轉染特定受體的細胞系或可連續傳代的非轉染細胞系。藥物作用于細胞后產生的反應包括細胞增殖、細胞殺傷、抗病毒活性、細胞分化、細胞因子/介質分泌及酶激活等。一般應盡可能根據藥物的作用機制來建立活性檢測方法，且確保選擇的細胞系在連續傳代后的一定代次內測定結果應相當。此外，基于細胞內信號轉導機制的快速反應目前也被廣泛用于活性方法的開發，如第二信使、蛋白激酶的激活或報告基因的表達等。許多用于生物活性測定的細胞系可表達多種細胞因子和生長因子的受體，因此需特別關注所建立的活性檢測方法的專屬性。

　　在許多基于細胞的生物活性測定試驗中，以下因素可能會影響生物活性的測定結果：細胞類型（貼壁或者不貼壁）；細胞復蘇；細胞接種密度和融合度（貼壁細胞）；細胞培養器皿；細胞生長和檢測培養基；培養用血清（來源、熱滅活、?射線輻照）；細胞培養條件（溫度、CO2、濕度、復蘇后培養代數）；細胞收獲的試劑和方法（貼壁細胞分離的方法）；細胞分類；細胞計數；細胞狀態鑒定（生長速率、活力、產量）；細胞傳代次數和傳代時間；細胞系的穩定性（遺傳性、受體、標記物、基因表達水平）；饑餓和刺激步驟。以上所列因素并未涵蓋所有需考量的因素，在生物活性測定方法建立過程中需根據具體情況鑒別影響結果的關鍵因素，并制定控制策略。

　　3.3 實驗劑量

　　建立生物活性測定方法時，應關注樣品和標準物質的量效關系，并按要求進行合理的劑量設計，使不同劑量之間的生物效應有顯著差異。高劑量不應使生物活性反應達到極限，低劑量應與陰性對照組有較為明顯的區別。限值劑量應以產生穩定的生物效應為宜；但在方法學研究時，應采用多劑量試驗，充分說明標準中設定限值劑量的依據。

　　3.4 方法建立程序

　　3.4.1 實驗參數的確定

　　通常生物活性測定方法屬于多因素模型。應考慮各個因素和潛在變量對于直接測量變量的影響。對于變異較大的生物活性檢測方法，耐用的多因素分析方法的建立對于生物活性測定方法尤為重要。對于生物活性測定方法建立和檢測性能優化而言，DOE是一種非常高效的統計策略，可有助于獲得滿足要求的測定系統。具體步驟如下：

　　風險分析：首先要對可能影響生物反應的測定因素進行系統檢查和風險評估，采用因果圖或魚骨圖等生物分析流程圖有助于將實驗影響因素可視化。以流程圖作為指導，實驗室可鑒別出可能影響檢測性能的各種因素，如緩沖液 pH、培養溫度、培養時間等。同時，可根據實驗經驗及科學判斷來確定進一步需要評估的關鍵因素。可采用失效模式及影響分析判斷哪些因素需要優先考慮，還需識別因素間潛在的相互作用。

　　篩選：一旦從風險分析中確定出潛在的關鍵因素，實驗室可通過初步的篩選實驗來探究所需控制的影響因素。常用析因設計和部分析因設計進行篩選實驗。可選擇專業的軟件完成篩選設計和數據分析。

　　響應優化：篩選設計常用于發現重要的影響因素，而這些因素可采用響應優化設計進一步進行研究。響應優化設計，如中心復合設計可用于確定達到預期響應時測定因素的最佳組合條件。從響應優化中獲到的信息可視作一個響應面，用來建立檢測性能的可接受范圍，并將其納入生物活性測定方法中。在進行此步驟的實驗設計時需注意，并不是所有的因素和隨機因素水平均需包含在內。此外，考慮試驗可能會受到隨機因素的影響，因此可利用區組設計避免此類因素的干擾。

　　確認：可采用各因素的最佳組合條件進行多次獨立試驗來進行最終的確認。對于已進行充分研究的檢測方法，可直接過渡到驗證。是否進行進一步的確認或驗證取決于整個研究過程中數據的積累程度。

　　3.4.2 標準物質和樣品的稀釋策略

　　試驗中可通過不同稀釋方式獲得標準物質溶液和樣品溶液。一種方式是系列稀釋法，該稀釋方法中每個稀釋度均由上一級濃度溶液逐級稀釋而來；另一種方式是每一濃度均分別獨立制備。這兩種稀釋方式均能獲得相同的標示濃度，但產生的誤差大小不同。系列稀釋法受稀釋過程中的誤差傳遞影響，稀釋早期產生的誤差將導致相關的、非獨立的檢測結果。多通道移液器的使用可能也會導致具有相關性的結果。而獨立稀釋法能幫助減輕源于稀釋誤差的偏倚。

　　3.4.3 方法建立中的數據分析

　　在生物活性測定方法建立時，對量效關系曲線特征的擬合，應找出樣品濃度與指標測定值的最佳擬合曲線。將試驗測定結果進行列表作圖，以劑量為橫坐標，以指標測定值為縱坐標，分析量效關系曲線的特征。必要時，可以對劑量進行轉換，如對數濃度；或者對指標測定值進行計算，如對數測定值。分析指標測定值出現顯著差異的劑量范圍可以通過方差分析或其他適用的統計方法，比較不同劑量之間的測定值之間是否存在顯著差異，找出與相鄰劑量的測定值存在顯著差異的劑量。

　　分析指標測定值的誤差來源的統計特征可以通過方差分析或其他統計方法獲得。判斷不同劑量之間的測定值是否存在方差齊性，在最佳擬合曲線下理論值與測定值差值是否符合正態分布，以更好了解測定值的誤差來源。

　　4. 生物活性測定方法的驗證

　　方法驗證需在方法建立完成后方可進行。在驗證研究之前，應擬定驗證方案，方案應包含分析方法的預期目的、待驗證的指標特性和相關標準的信息，驗證中獲得具有統計學意義的結果是達到可接受標準的驗收準則。此外，驗證方案亦需包括驗證結果達不到其目標驗收準則時的處理措施。

　　4.1 驗證方案

　　驗證方案應包括驗證設計、驗證指標、合理的可接受標準和數據分析計劃等，同時還應對不滿足可接受標準時需采取的措施加以規定。

　　驗證設計主要涉及樣品的選擇（包括樣品的數量和類型）、實驗變異來源及重復策略等。應采用具有代表性的樣品進行驗證試驗，驗證過程中需綜合考量試驗內和試驗間變異的來源，使用的重復策略應盡量反映影響效價測定結果的實驗因素。

　　由于生物活性測定方法各具特點，因此需視具體方法擬訂具體的驗證指標，并根據測定方法特點和驗證目的來確定各驗證指標的可接受標準。同時還應分別建立試驗有效性的可接受標準（系統適用性要求）和樣品結果有效性的可接受標準（樣品適用性要求），這些標準可根據方法開發的情況制定，但最終需根據驗證的數據進行修正并在驗證完成前確定。

　　驗證方案中應列出明確的數據分析計劃以對驗證結果進行分析，包括對驗證指標結果的繪圖和統計學分析，以及判斷它們是否符合可接受標準等。

　　生物活性測定方法驗證方案中還需規定所需的樣本量和驗證次數。樣本量是指使用同一樣品進行方法驗證的獨立重復實驗次數。其目的是獲得有足夠把握度的方法性能參數，以確保所得方法性能參數滿足其預期用途的結論是可靠的。對于試驗變異較大的生物活性檢測方法，確定并使用合適的驗證次數是方法驗證中需要考慮的重要內容。如果所用的驗證實驗次數過少，會導致檢驗效能下降，得到的方法性能參數不穩健，最終導致所得方法滿足預期用途的結論具有較大風險。方法驗證所需的樣本量及驗證所需獨立重復的實驗次數，應根據方法的變異大小和設計方案確定。

　　 4.2 各驗證指標的驗證策略

　　生物活性測定方法常見的驗證指標包括專屬性、相對準確度、精密度、線性和范圍，后四個指標的驗證通常可進行合并設計，具體參見生物制品生物活性/效價測定方法驗證指導原則（指導原則 9401）。

　　4.2.1專屬性

　　生物活性測定方法的專屬性與產品成分密切相關，對有明確功能主治藥物的活性測定方法，當采用確定的檢測方法測定時應表現確定的陽性結果。對于含有復雜基質的產品或中間產物，專屬性指標可證明其活性不受基質成分和產品相關組分的干擾。專屬性的測定方法是采用平行稀釋標準樣本，同時加入和不加入潛在的干擾物質進行回收率試驗。如計算的效價符合期望值，則認為專屬性滿足要求。相對于化學藥品分析方法的專屬性而言，生物活性測定法的專屬性除考慮雜質、降解產物等對測定結果的干擾外，更應著重區分具有相關生物活性成分的能力。

　　4.2.2相對準確度

　　準確度體現該方法測得值與標示值的接近程度，表示為（測得值/ 真實值)×l00%。在生物效價的測定中，相對準確度是反映相對效價實測值與相對效價已知值之間關系的一個指標。在相對效價的生物活性測定法中，最常見確定相對準確度的途徑是采用標準物質或已知效價樣品的系列稀釋來確定其效價的方式。相對準確度采用每個效價水平點的相對偏倚和各效價水平相對偏倚的趨勢來進行評價。

　　樣品濃度或劑量的設置應結合方法的預期用途(質量標準的范圍)來確定，對于生物效價測定至少設置 5 個等劑距的濃度水平，其中，中間 3 個濃度分別是質量標準規定的上/下限、以及目標值所對應的濃度。

　　4.2.3 精密度考察

　　應進行重復性、中間精密度、重現性考察。生物效價測定方法的精密度一般采用幾何標準偏差或幾何變異系數表示。

　　重復性：在相同條件下，由同一個分析人員測定所得結果的精密度。至少用 3 批樣品、每批 3 次或同批樣品進行 6 次測定試驗后對結果進行評價。

　　中間精密度：考察實驗室內部條件改變（如不同人員、不同儀器、不同工作日、關鍵試劑和實驗時間）對測定結果的影響，至少應對同實驗室改變人員進行考察。

　　重現性：生物活性測定試驗結果必須在 3 家以上實驗室能夠重現。

　　4.2.4 線性

　　線性通常系指與相對準確度相關的稀釋線性，是在設計的范圍內，評估測得的生物效價與真實值或參考值之間的線性關系。

　　4.2.5 范圍

　　生物活性測定法的測定范圍是指在實驗操作的相對準確度和精密度滿足要求的前提下，所測定的生物效價的高低限值之間的范圍。該范圍通常由稀釋度線性研究得出，應至少完全涵蓋產品質量標準所涉及的效價范圍。為了檢測產品的穩定性或為了盡量減少過高/過低效價的樣品在實驗中必要的稀釋/濃縮，在進行方法驗證研究時，應適當擴大驗證范圍。

　　4.3 驗證結果的記錄

　　驗證結果應記錄在驗證報告中。驗證報告可包含預驗證的實驗結果、正式驗證的原始數據、中間結果及最終報告結果及結論等。若驗證結果均符合可接受標準，從驗證報告即可得出測定方法適用于其檢測目的的結論；反之，當驗證結果與驗證方案規定的可接受標準有偏差時，應對驗證失敗的原因進行分析，并提出失敗后的糾正措施，如優化方法的實驗條件或視情況修正可接受標準等。

　　5.生物活性測定方法的持續確認和維護

　　經驗證后開始常規使用的生物活性測定方法，仍需對其性能進行持續監控。常用的監控方法如統計過程控制（statistical process control，SPC）圖法，可對適宜的參數如標準品的劑量反應曲線和質控品的效價測定值等進行持續監控，以識別測定方法早期的波動或漂移，若在 SPC 圖中觀察到任何變化趨勢，即應對產生該趨勢變化的原因進行調查。

　　將生物活性測定方法轉移至不同實驗室時，應進行部分或全部性能特性的再驗證，也可采用代表性樣品進行比較分析。

　　6. 生物活性測定方法的變更

　　生物活性測定方法在整個產品生命周期內均有可能發生變更，可能涉及現有方法的修訂或新技術的完全替代。引起變更的常見原因包括：工藝變更、關鍵試劑變更、試驗系優化、根據持續確認和維護引起的變更等。方法性能特性和產品質量屬性的重大變更可能導致對 ATP 的重新評價和/或建立新的方法。如新方法的原理發生改變，應按照生物活性開發和驗證程序進行，并全面驗證，同時考慮對代表性樣品和標準物質進行對比分析和/或證明變更后優于或等同于變更前的分析方法。

附件 生物活性測定方法設計、建立及驗證指導原則公示稿（第一次）.pdf