生物芯片在功能基因組學研究中的應用進展

發布時間：2021-05-25 09:58 原文鏈接：生物芯片在功能基因組學研究中的應用進展

   生物芯片技術是伴隨人類基因組研究發展起來的，它是指通過微電子、微加工技術，在固體基質（如硅芯片、玻片、瓷片等）表面構建的微型生物化學系統，以實現對細胞、蛋白質、核酸及其它生物組分進行快速、敏感、高效地處理。一般來說，應用芯片進行實驗主要包括3個步驟：樣品制備、生物化學反應、檢測和數據分析處理。生物芯片可分為三類：DNA及寡聚核苷酸的微型陣列（microarray）芯片（也稱為DNA芯片或基因芯片）、蛋白陣列及其它芯片，如樣品制備芯片、核酸擴增芯片、毛細管電泳芯片及多功能集成的縮微芯片實驗室（LOC）等。近年來，生物芯片技術的應用領域不斷拓展，早已從最初的雜交測序延伸到基因組功能研究的各個方面，本文著重對生物芯片中發展最快的DNA芯片和蛋白陣列在功能基因組研究中的應用進展作一個介紹。

1   DNA芯片在突變及多態性研究中的應用
    以往的突變及多態性檢測手段都不適應大規模、低消耗和自動化的要求，應用DNA芯片方法檢測則可克服這些不足，且隨著芯片技術的不斷發展，其檢測速度、特異性和敏感性也不斷提高，尤其是第三代遺傳標記單核苷酸多態性（SNP）的出現，使得可以更方便地應用DNA芯片進行大規模多態性檢測，進而研究基因多態性和疾病的關系，同時也可以研究致病的機制。
許多人類腫瘤以基因組的不穩定性、多種突變的積等位基因不平衡（allelicimbalace）為特征，雜合缺失（LOH）是等位基因不平衡的常見形式，通過對LOH的檢測，可鑒定含有腫瘤抑制基因的基因組區域，并描述腫瘤的臨床階段及發展情況。Mei等聯合應用人類基因多態性標記SNPs與高密度DNA微陣列，在整個基因范圍內檢測等位基因不平衡的情況，他們應用的微陣列含有豐富的探針組，針對于散布在所有人類染色體的600個基因位點，其檢測所得結果用傳統的基于凝膠的方法得到了證實。表明了將大量SNPs標記與芯片結合檢測LOH及其它染色體改變可實現對等位基因不平衡類型的鑒定，從而促進對腫瘤的診斷及預后評估。
　　Takahashi等用新近開發的p53基因芯片分析胃腸道腫瘤患者的基因突變，6通過對位胃腸道腫瘤患者的分析，證實了其中一個結腸癌患者的原發瘤樣本中，在其外顯子8的第273位密碼子處發生了雜合性點突變（CGT→CAT），并且，從同一患者的肝轉移灶樣本中檢測到兩個雜合性點突變，其中一個與原發瘤中相同，另一個發生在外顯子6的第217位密碼子上（GTG→GGG）。如果聯合應用雙色熒光原位雜交（FISH），則不僅可檢測p53基因缺失和17號染色體非整倍型，而且可檢測p53突變，從而研究胃腸道腫瘤發生發展的機制。
　　Tonisson等開發了一種基于寡核苷酸芯片的陣列引物延伸（arrayed primer extension, APEX）方法，其原理是將寡核苷酸引物（其3端與特定SNP或突變位點互補）5末端固定在玻片基質上，患者DNA經PCR擴增，酶消化后與固定在芯征上的引物退火，因而促發了模板依賴性的DNA聚合酶延伸反應，應用四種不同熒光標記的雙脫氧核苷酸作為反應底物，通過引物位點的顏色信號改變即可檢測突變。他們應用BRCA1基因突變及SNP基因型鑒定芯片作為模型系統，芯片表面化學、模板制備以及APEX反應條件均可優化，可用于進一系列DNA分析，包括SNP檢測、基因突變及DNA重新測序等。Kurg等將這種新型芯征用于分析10種常見的-地貧突變，其中9位患者的DNA樣品（各攜帶一種不同的突變）和4個野生型DNA樣本均被正確鑒定，且其平均信噪比是40：1，因而足以高度準確地鑒定雜合突變，此研究結果證實了APEX方法可有效地應用于各種DNA的突變和多態性分析。另外，Pastinen等也用類似的方法即微陣列上的等位基因特異性引物延伸反應（allele-specific primer extension on microarrays）來進行高通量的SNPs基因型鑒定及突變檢測。他們用低豐度物點樣制作微陣列，產生可測定40個突變位點或SNPs，的8000種以上的基因型，最后的研究結果顯示，所有的已知基因型均被正確鑒定。

2   DNA芯片在基因組的表達及調控研究中的應用
    基因在不同組織細胞、不同發育階段、不同生理病理狀態以及各種治療條件下的表達水平反是非曲直了基因的功能住處，了解這些信息對于闡明疾病的發生發展機制非常重要。利用DNA測序或PCR差異顯示等方法研究基因差異表達都較為費力且不靈敏，為了能夠全面而不孤立地評價全部基因組的表達情況，需要一種高度敏感和高效率的工具系統，DNA芯片便是適應這一要求的理想選擇，它可在一次實驗中分析上萬個基因的表達模式，且敏感性水平達到<1個拷貝/細胞，從而可提供基因功能線索，有助于鑒定治療干預的適合靶點，也可用于監測藥物治療后基因表達的改變。近年來，關于芯片在基因表達方面的研究進展非常迅速。
　　2.1 利用DNA芯片研究疾病狀態基因的差異表達模式 CpG島的過度甲基化是腫瘤中的常見后發事件（epigeneticevent）,最近Yan等發展了一種基于微陣列的方法，稱為差異性甲基化雜交（differential methylation hybridization,DMH）,他們制備了含1104個CpG島標簽的微陣例，用于篩查28位配對的原發乳腺癌和正常樣本，結果顯示，其中將近9%的標簽在大部乳腺癌樣本中的甲基化程度相對于他們的正常對照有顯著增加，同時揭示出CpG島過度甲基化與乳腺癌的組織學程度關。
    Elek等從正常人和三個獨立的前列腺癌患者體內提取Mrna,將其反轉錄成cDNA后制備成含588個基因的微陣列，并將其用于基因差異表達分析，發現其中至少19個基因在腫瘤及正常組織中差異表達，提示微陣列與相關cDNA 庫結合，能促進對診斷和治療前列腺癌及其它腫瘤的潛在靶點的快速鑒定。
　　2.2 利用DNA芯片研究病原體感染后宿主基因表達模式的改變為了在mRNA水平上全面了解HIV感染CD4+T細胞后產生的總體效應，Geiss等用cDNA微陣列分析了大約1500個受HIV-1感染的細胞的cDNAs，發現在感染后2天左右，宿主細胞基因表達幾乎無改變，但在感染后3天時，可檢測出20種細胞基因有差異表達。其中包括參與T細胞信號傳導、亞細胞運輸（subsellular trafficking）、轉錄調節的基因以及其它一些未知基因。這些結果支持了關于HIV-1感染將導致大量細胞基因表達改變的假說，并為將來進一步研究差異性表達mRNA產物的功能提供了框架。
　　2.3 利用DNA芯片檢測藥物治療對基因表達的影響有研究者應用高密度微集芯片在酵母中檢測藥物治療對基因表達的影響，在其中一個研究中，應用芯片在酵母基因組水平上檢測了激酶抑制劑治療前后mRNA水平的變化，從而分析蛋白激酶抑制劑對基因表達的影響。另外一項研究報道了免疫抑制性藥物FK506作用于酵母后，產生了一種特征性基因表達模式。這種表達模式在無效突變體的酵母細胞（帶FK506作用靶點）中也可觀察到，表明部分的藥理功能缺失仍可引起相似的基因表達改變。同時，在此實驗中也發現了不同于藥物最初靶點的其它通路，如果將類似的方法應用于人細胞及組織，將大大提高新藥鑒定及藥效評估的效率。
　　2.4 利用DNA芯片進行模式生物體中的基因表達及功能研究模式生物體的基因組織結構相對簡單，但是它們的核心細胞過程和生化通路在很大程度上是保守的，通過對其研究，可加速對人類基因結構和功能的了解。
　　為了有效的獲得有關哺乳動物發育中涉及的基因表達、調節和功能的住處，Kelly等應用ClontechsAtlas鼠cDNA表達微陣列檢測了588個已知調節基因在D3 ES細胞（胚胎干細胞）及維甲酸（retinoic acid ,RA）誘導其分化產生的后代細胞中的表達。發現將近50%的調節基因在D3和/或D3分化細胞中表達，其中，分別人18個和61個基因以2.5倍以上的水平發生了下調和上調，這些基因的表達改變具高度重復性，并代表一系列分子標記的表達改變，包括：轉錄因子、生長因子及其受體、細胞骨架蛋白和細胞外基質蛋白、細胞表面抗原以及細胞間信號轉導調節者和效應物。
    另外，生物芯片還可用于在模式生物上進行“基因改變——功能改變”的研究，即通過破壞或操縱基因的手段，使靶基因在模式生物基因組中被“敲除”（knock out）或增中，從而制造出基因敲除動物或轉基因動物模型，然后，檢測這種模型動物生物學功能的改變，這是了解特定基因功能重要途徑。Shoemaker通過PCR打靶策略，使酵母中未知功能的開放閱讀框（ORFs）被敲除，從而產生了11株酵母營養缺失突變株，并分別以一特異的20體寡核苷酸序列（將其稱為分子條形碼）作閱覽室記，然后將其置于特殊的生長條件下選擇培養，并將合并活突變株的分子條形碼擴增、標記后與DNA芯片上的探針雜交，這樣方便地定出存活株，并分析ORF的生物學功能，提示此法可擴展到人類基因組未明ORF生物功能的研究，從而促進對生命現象的認識，并為藥物治療提供新的靶點。

3   DNA芯片在比較基因組學研究中的應用
　　應用高密度芯片對模式生物基因組進行大規模的測序，并對人類基因組進行重新測序，進而對進化過程中各個階段不同生物基因序列的保守性及差異性進行比較研究，將有助于揭示基因功能和疾病分子機制，闡明物種進化關系。
　　Hacia等利用芯片技術對與人進化相近的黑猩猩和大猩猩等物種的同源基因BRCA1的外顯子11的序旬進行比較分析，證明在3.4kb中有83.5%-98.2%的核苷酸相同，與雜交法和雙脫氧測序分析所得的結果一致，這說明芯片技術可大大加快比較基因組學研究的進程。

4   蛋白陣列在蛋白質組學研究中的應用
　　“蛋白質組”這一名稱是由兩位澳大利亞科學家Wilkins和Williams于1994年在意大利的Siena召開的雙向電泳會議上提出，是指細胞內全部蛋白質的存在及其活動方式。蛋白質組學就是以蛋白質組為研究對象，從整體上研究蛋白及其修飾狀態以及蛋白質之間的相互作用。目前蛋白質組學研究的主要方法是二維蛋白質凝膠電泳。最近，在基于微孔板的傳統免疫分析的發展及DNA微陣列技術的推動下，一種新的遺傳分析手段——蛋白陣列技術導速發展起來，它可應用于高通量的基因表達分析、分子活動及分子間相互作用等方面。因而它將在蛋白質組學等功能研究領域發揮重要作用。
　　Walter等將4800種從人胎腦cDNA表達庫hExl的液體表達培養中得來的樣本排列在丙烯酰胺（polyacrylamide）包被的顯微玻片上蛋白陣列，用于進行同步篩查。最近開發出的一種高通量的基質輔助激光解吸附離子化飛行時間質譜技術（MALDI-TOF-MS），使得蛋白陣列檢測結果更加穩定、快速且高度準確。Ge等應采用低密度UPA系統研究分子間相互作用，其中分別采用蛋白質、DNA、RNA以及小分子化學配體作為探針。蛋白陣列也將成為重組抗體文庫篩選的首選工具，英國劍橋醫學研究委員會的IM T及其同事已經應用hEx1蛋白濾膜（hEx1 protein filters）開發一種新的篩查系統，可用于分離針對于人類蛋白質中多不同靶標的特異性抗體。

5   生物芯片技術存在的問題與改進方法
    經過十多年發展，生物芯征技術已日臻完善，其應用前景非常廣闊，但在現階段它仍存在一些亟待解決的問題，如該技術需要昂貴的設備，成本較高，且其特異性、靈敏度以及集成度仍有待提高。相信將來隨著芯片的大規模批量生產，以及其集成度的不斷提高，其價格將不斷優化。
    針對芯片的特異性問題，有人提出用肽核酸制備芯片，肽核酸是一種核酸類似物，具有很多優點，如親和性高、適配性好，可識單堿基錯配，其雜交受溶液中鹽的影響很小。此外Miyachi等開發了一種新的芯片固定技術，他們用hexam-ethyldisiloxane(HMDS)形成的聚合膜（plasma-polymerized film, PPF）使鏈親和素固定于玻片基質上，鏈親和素被置于兩層HMDS之間，結合了生物素的分子（biotinylated molecules）能被有效地捕獲，而這種HMDS-PPF的疏水性可減少非特異DNA在玻片上的結合，從而大大提高了檢測的特異性。
    為了進一步提高芯片的敏感性，Taton等用寡核苷酸修飾的納米金屬微粒探針（gold nanoparticle probes）和傳統的平底（flatbed）掃描儀行聯合DNA陣列分析，他們應用納米金屬微粒而不是熒光標記探針，此法對含單個錯配核苷酸的靶核酸序列的選擇性比熒光標記檢測中觀察到的要高出三倍，如果進一步將其與一種基于納米微粒促進的銀鹽還原（nanopar-ticle –promoted reduction of silver）信號擴方法偶聯時，這種掃描儀陣列檢測系統比類似的熒光系統靈敏度要高兩個數量級。
　　另外，不久前Umek等開發了一種生物電子檢測平臺，這種NDA芯片平臺可與同質性分析（homogeneous assays）相容，因為它無需分別標記，也無需沖洗步驟，其一步完成，電極陣列的分析首先是在室溫下進行的，然后將溫度提升，此時，含錯配靶核酸的電極產生的電信號將在高溫下明顯減弱。這種芯征可大大加快對突變及多態性的檢測。