用PCR控制基因組DNA文庫的質量實驗分析測試百科網wiki版

發布時間：2019-09-13 12:06 原文鏈接：用PCR控制基因組DNA文庫的質量實驗

試劑、試劑盒	ddH20 Vent 緩沖液 Vent DNA 聚合酶 dNTP 質粒 DNA PCR 引物
儀器、耗材	瓊脂糖凝膠電泳所需的試劑和設備熱循環儀
實驗步驟	一、材料 1. 緩沖液、溶液和試劑 ddH₂0 2. 酶和酶緩沖液 10X Vent 緩沖液 Vent DNA 聚合酶 3. 核酸和寡核苷酸 dNTP，各 20 mmol/L PCR 引物，可以與基因組 DNA 文庫克隆位點兩側的載體序列退火質粒 DNA(見下面第 1 步） 4. 特殊設備瓊脂糖凝膠電泳所需的試劑和設備，包括溴化乙錠 (見第 5 步）熱循環儀二、方法 1. 在細菌中擴增后，用基因組文庫制備的質粒 DNA 建立下列反應。 10~50ng 的質粒 DNA 50pmol 的各引物 5ul 的 10XVent 緩沖液 dATP、dCTP、dTTP 和 dGTP, 各 0.5ul 1U 的 Vent DNA 聚合酶用 ddH₂0 定容至 50ul 對下面的每種質粒載體應該分別進行反應：表達載體，沒有文庫 DNA 插入基因組 DNA 文庫的混合物少量 DNA, 由基因組 DNA 文庫的單個細菌克隆制備 2. 在一個熱循環儀中，94°C 將混合物預熱 20s。 3. 按下面的參數進行 30 輪 PCR 循環。 94°C15s 55°C10s(或用引物的合適退火溫度） 72°C40s 將最后一次循環的延伸時間延長至 60s。 4. 冷卻至 4C。 5. 取 25ul 的各反應產物，跑 4% 的瓊脂糖凝膠電泳，并用溴化乙錠染色分析（Sambrook and Russell 2001) 三、分析在圖 26-6 所示的例子中，對文庫混合物進行 PCR 分析，其中用的引物是 PmlⅠ位點的側翼序列，結果顯示，文庫中含有目的大小的插入片段，但有大量的原始載體的污染 [圖 26-6(a), 第 2 泳道]。從文庫中選擇單個克隆進行 PCR 分析，驗證了用文庫混合物做模板的結果，顯示文庫中的原始載體大約占 40%[所分析的 24 個克隆中有 10 個，圖 26-6(a), 第 3~26 泳道]。為了提高文庫的質量，用 PmlⅠ酶消化文庫，然后在細菌中重新進行擴增，以減少原始載體的污染。對文庫混合物進行 PCR 分析顯示，用 PmlⅠ消化后，無插入的環狀載體的污染大大減少了 [圖 26-6(b), 第 2 泳道和第 3 泳道]。用 PmlⅠ消化又重新在細菌中擴增后，在文庫中隨機選擇單個克隆進行 PCR 分析，證實無插入 DNA 的出現頻率比原始文庫大大降低 [20 個克隆中有 0 個，小于 5%，圖 26-6(b), 第 4~23 泳道]，并且克隆中含有預計大小的插入片段。對基因組片段文庫中的克隆進行 DNA 序列分析顯示，文庫中含有預計大小的人類基因組 DNA 片段（數據沒有列出）。因此，PCR 提供了一個快速、敏感和方便的方法，來分析原始的和改善過的文庫。展開

試劑、試劑盒

ddH20 Vent 緩沖液 Vent DNA 聚合酶 dNTP 質粒 DNA PCR 引物

儀器、耗材

瓊脂糖凝膠電泳所需的試劑和設備熱循環儀

實驗步驟

一、材料

1. 緩沖液、溶液和試劑

ddH₂0

2. 酶和酶緩沖液

10X Vent 緩沖液

Vent DNA 聚合酶

3. 核酸和寡核苷酸

dNTP，各 20 mmol/L

PCR 引物，可以與基因組 DNA 文庫克隆位點兩側的載體序列退火

質粒 DNA(見下面第 1 步）

4. 特殊設備

瓊脂糖凝膠電泳所需的試劑和設備，包括溴化乙錠 (見第 5 步）

熱循環儀

二、方法

1. 在細菌中擴增后，用基因組文庫制備的質粒 DNA 建立下列反應。

10~50ng 的質粒 DNA

50pmol 的各引物

5ul 的 10XVent 緩沖液

dATP、dCTP、dTTP 和 dGTP, 各 0.5ul

1U 的 Vent DNA 聚合酶

用 ddH₂0 定容至 50ul

對下面的每種質粒載體應該分別進行反應：

表達載體，沒有文庫 DNA 插入

基因組 DNA 文庫的混合物

少量 DNA, 由基因組 DNA 文庫的單個細菌克隆制備

2. 在一個熱循環儀中，94°C 將混合物預熱 20s。

3. 按下面的參數進行 30 輪 PCR 循環。

94°C15s

55°C10s(或用引物的合適退火溫度）

72°C40s

將最后一次循環的延伸時間延長至 60s。

4. 冷卻至 4C。

5. 取 25ul 的各反應產物，跑 4% 的瓊脂糖凝膠電泳，并用溴化乙錠染色分析（Sambrook and Russell 2001)

三、分析

在圖 26-6 所示的例子中，對文庫混合物進行 PCR 分析，其中用的引物是 PmlⅠ位點的側翼序列，結果顯示，文庫中含有目的大小的插入片段，但有大量的原始載體的污染 [圖 26-6(a), 第 2 泳道]。從文庫中選擇單個克隆進行 PCR 分析，驗證了用文庫混合物做模板的結果，顯示文庫中的原始載體大約占 40%[所分析的 24 個克隆中有 10 個，圖 26-6(a), 第 3~26 泳道]。為了提高文庫的質量，用 PmlⅠ酶消化文庫，然后在細菌中重新進行擴增，以減少原始載體的污染。對文庫混合物進行 PCR 分析顯示，用 PmlⅠ消化后，無插入的環狀載體的污染大大減少了 [圖 26-6(b), 第 2 泳道和第 3 泳道]。用 PmlⅠ消化又重新在細菌中擴增后，在文庫中隨機選擇單個克隆進行 PCR 分析，證實無插入 DNA 的出現頻率比原始文庫大大降低 [20 個克隆中有 0 個，小于 5%，圖 26-6(b), 第 4~23 泳道]，并且克隆中含有預計大小的插入片段。對基因組片段文庫中的克隆進行 DNA 序列分析顯示，文庫中含有預計大小的人類基因組 DNA 片段（數據沒有列出）。因此，PCR 提供了一個快速、敏感和方便的方法，來分析原始的和改善過的文庫。