病原菌的分離鑒定及其疫苗的制備（3）

（二）疫苗制備
1 ．病原菌的擴大培養與分離
液體培養：按配方配制 2216E 液體培養基，將培養基用 三角燒瓶分裝并蓋上棉塞后置 于高壓蒸汽鍋內， 121 ℃ 滅菌 15 ～ 30min ，冷卻后于超凈工作臺內加入 1ml 左右預先制備的病原菌菌液，蓋上棉塞，用搖床于 28~ 30 ℃ 下震蕩（約 150rpm ）培養 24~48h 。病原菌經擴大培養后以 3000~5000rpm 離心 20~30min ，取沉淀用 PBS （磷酸緩沖液）配制成 1% 或 1 ‰左右 的菌懸液。
茄子瓶擴大培養：按配方配制 2216E 瓊脂培養基，于高壓蒸汽鍋內， 121 ℃ 滅菌 15 ～ 30min ，趁熱倒入經干熱消毒的茄子瓶內（每瓶約 15ml 培養基），茄子瓶用消毒棉塞封口后平放于超凈工作臺臺面，稍予搖動使培養基平鋪于瓶壁，冷卻后制成茄子瓶平板。用無菌滴管吸取預先制備的病原菌菌液，在每個茄子瓶平板表面滴加 3~4 滴，再用經灼燒消毒并冷卻的玻璃涂布器將菌液涂布均勻， 28~ 30 ℃ 下培養 24~48h 。用無菌 PBS 洗脫平板表面的菌苔，洗脫液經 3000~5000rpm 離心 20~30min ，取沉淀用 PBS （磷酸緩沖液）配制成約 1% 或 1 ‰ 的菌懸液。
2 ．滅活
化學滅活：以福爾馬林作為化學滅活劑。滅活前先確定福爾馬林對該病原菌的安全滅活濃度，確定方法為：取 7 支滅菌試管，分別 5ml 加入預先制備病原菌菌液，其中 6 支裝有菌液的試管分別依次加入一定量的福爾馬林，使福爾馬林的終濃度分別為 0.1% 、 0.2% 、 0.4% 、 0.6% 、 0.8% 、 1.0% ，另 1 支試管不加入福爾馬林作為對照；于 4 ℃ 下放置 24h 后，于每支試管中分別取 0.2ml 菌液于 2216E 瓊脂平板上涂布， 28~ 30 ℃ 下培養 48h ，檢測各試管內細菌的存活情況，只有沒有細菌生長的對應福爾馬林濃度才是該病原菌的滅活安全濃度。向第 1 步中制備的 1% 菌懸液內添加福爾馬林，使福爾馬林的最終濃度達到安全滅活濃度以上， 于 4 ℃ 下放置 24h ，制備滅活菌液。
其他滅活方法：除化學滅活，疫苗制備時還可采用熱滅活、紫外線和超聲波滅活等方法。
3 ．安全性檢測
活性檢測：取 0.2ml 滅活菌于 2216E 瓊脂平板上涂布， 28~ 30 ℃ 下培養 48h ，只有在瓊脂平板上沒有出現菌落出現才說明滅活徹底，滅活菌液中確實沒有活菌存在。
安全檢測：將所制備的滅活菌液稀釋成疫苗接種所用的濃度（一般為 10 8 cfu ），用注射法將稀釋后的滅活菌液接種到無患病史的同種寄主動物（水產養殖動物）體內，經 20d 觀察無發病或死亡才說明該滅活細菌是安全的。
4 ．效果檢測
抗體效價檢測：用注射法將稀釋后的滅活菌液接種到 無患病史的同種寄主動物（水產養殖動物）體內，連續養殖 2 個月，從第 10d 開始每隔 10d 取 3 尾以上接種生物用 微量血凝板法檢測其平均凝集抗體效價 。抗體效價檢測方法為：抽取感染動物血液并離心分離血清，用取樣器吸取 0.1ml 血清加入經滅菌的 96 孔板的 A1 孔內，在 96 孔板 A 行的其他孔內加入 0.05ml 無菌 PBS ，從 A1 孔內取 0.05ml 血清加入 A2 孔內，混勻后再從 A2 孔內取 0.05ml 液體加入 A3 孔內 …… ，如此重復，使 96 孔板內后 1 個孔內的血清濃度均比前 1 個孔低 1 倍（倍釋法），再在 96 孔板的每個孔內加入 0.05ml 菌液（活的或滅活的均可）， 37 ℃ 孵育過夜后觀察（最好在 96 孔板下墊一張黑紙以增加反差），出現沉淀的最高血清稀釋倍數即為血清中所含抗病原菌抗體的效價。比較不同時期內抗體效價的變化情況，確定最高抗體效價值。一般情況下，抗體效價越高，滅活細菌作為疫苗的效果就最好。
攻毒感染實驗：選擇 無患病史的同種同齡寄主動物（水產養殖動物）作為感染對象，用注射法進行攻毒感染。 用注射法將稀釋后的滅活菌液接種到 無患病史的同種寄主動物（水產養殖動物）體內，連續養殖 2 個月，從第 20d 開始每隔 20d 取 10 尾以上接種生物用 活的病原菌進行感染，感染方法為： 。
（二）致病菌的人工感染
1) 實驗材料：嗜水氣單胞菌斜面（每組 2 支），試管架（ 1 個）酒精棉球（ 1 瓶），無菌生理鹽水，滅菌空試管，麥氏比濁管。
2 ）實驗方法：用裝有針頭的注射器（或無菌吸管），吸取無菌生理鹽水，滴注到培養有嗜水氣單胞菌的斜面上，振蕩使斜面上的菌落洗下（或用滅菌接種環輕輕刮下），倒入滅菌空試管中，用無菌生理鹽水稀釋調節菌濃度，與麥氏比濁管進行比色，使菌濃度達到 2.1×10 9 個細菌 /ml （ 21 億），用滅菌注射器抽取菌懸液，待人工感染時用。注射部位在魚的背鰭前端與側線之間的中部區域。用酒精棉球在注射部位擦拭進行體表消毒后進行肌肉注射。針尖斜向魚的頭部，與魚體成 30° 左右的角度插入肌肉，注射深度在 1 ～ 1.5 cm 。每尾魚注射量為 0.6 ml ，每天觀察魚的發病及癥狀等情況并做好記錄。