白話膠體金系列——第一話<燒金>（一）

1.金子大小：常用20、40、60nm的膠體金顆粒（粒徑大小），另外，在說金子大小的時候，有些人還用λ525、530表示，這個是指膠體金最大吸收峰位置，理論上這個值比說40nm要準確，因為40nm是估的，這個是實實在在測的，但是他與顆粒大小僅僅有“一定的“關系，而且這個”一定的“很不一定。其他要說明的是，顆粒越小，顏色越粉嫩（偏粉紅），最終顯色越弱，特異性相對越好；相反顆粒越大，顏色越老土（偏紫，但70nm以上就真的土了，有點泥巴色了），顯色越強，特異性相對越差。

2.金子濃度：萬分之一、萬分之二、萬分之四等等，指燒金時溶液中氯金酸的濃度。由于反應非常迅速，濃度越高，金子質量越不容易控制，標記時的表現也是這樣，高濃度金不容易控制。注意當別人問你用多大濃度的金子時，不要回答人家40nm或λ530的，這會比較尷尬。

3.反應原理：氯金酸被檸檬酸三鈉還原成膠體金顆粒，其過程為金離子（并非全部）→還原成金原子→迅速形成20面體的金核→其他金原子吸附到晶核上→生長成橢球形的帶負電的金顆粒（雙電層結構，膠體金表面吸附著負電的AuCl2-離子，相對的H+則分散于膠體之間的溶液中）。

氯金酸一定時，還原劑數量決定了最初的晶核數量，決定了膠體金顆粒的大小。還原劑越多，晶核數量越多，最終的顆粒體積越小，通過控制二者比例，我們可以制備不同大小的膠體金顆粒。常用的40nm左右的金，發紅色，一般是1:1的關系，由于不同廠家原料也有影響，如果你感覺燒出來的偏紫，又很想要紅色，下次燒金就再稍微增加點還原劑即可，試劑比例--金子大小--最大吸收峰--顏色，這四者的對應關系各種文獻說法不一，我們也沒必要太糾結。如前所述，金子大小與最終的產品性能有一定的關系，所以重要的是實驗之初你要從試劑盒反應原理上確定是要大金子還是小金子，而不用去糾結40nm還是50nm，酒紅色還是紅色，最大吸收峰位置是525還是528。

燒金最重要的是一致性，不要這次燒出來粉紅的，下次相同條件燒出來紫的就行了。而這個很考驗細節，理論上，發生反應并且形成晶核的均一性，決定了最終膠體金顆粒的均一性，不幸的是，這個過程太快了，很難控制，發生的一瞬間結果就已經注定了。就像生孩子一樣，你再怎么想要閨女，最后生出來也可能是個兒子，而你只能安慰自己生男生女都一樣，然后默默的努力掙錢給兒

子存老婆本。

4.膠體的穩定性問題：膠體金本身是疏水膠體，會因疏水作用力結合而聚集（隨著聚集的程度加重，顏色由紅→紫→藍→黑），但因顆粒外層負離子的靜電斥力而穩定懸浮于水中，加入NaCl等鹽離子會破壞負電斥力（其實調節PH加碳酸鉀也有這種影響），導至膠體金顆粒通過疏水作用力結合而死金，而我們標記后的膠體金因為結合了蛋白和合適的封閉，變成了親水的膠體，減少了疏水結合的位點，所以正常來說金標物更穩定，更耐受環境的破壞（當然不穩定的情況也很常見，比如標記死金，封閉死金，離心死金，復溶死金，甚至層析過程中死金，遇到這種情況有一個好辦法，就是想辦法讓他穩定，原理就擺在這里了），這也是優化標記條件時NaCl滴定法的理論基礎，但理論是個好理論，只是NaCl滴定法不正經，不推薦使用，后面標記的章節會再次介紹。

關于穩定性問題，也有說是鹽破壞了膠體金的水化膜導至聚集，但是親水膠體才主要由水化膜起穩定作用，比如蛋白質，而破壞水化膜需要大量的鹽，即鹽析作用。相反，膠體金是疏水膠體，幾乎不形成水化膜，少量鹽就會導至死金，所以我認為，膠體金穩定主要是靠負電斥力（而非水化膜），這也是維持疏水膠體穩定的主要作用力。

5.死金：是指膠體金聚集狀態，表現多樣，輕者整體變紫，重者變黑并沉淀，還有漂在表面的一層油狀物，或懸在液體中的一些不溶物。我們研發時一般都追求穩定的不死金的狀態，而死金的狀態能夠達到更高的靈敏度，所以在某些具體產品上，或者某些公司的整體考量上，也有追求死金的時候，所以你看到別人的產品跑出來深紫色或者黑色的線條，也無需大驚小怪。

1.使用18.2兆歐水將氯金酸配制成1%的溶液，再取1%的氯化金1ml稀釋成100ml（即0.01%）。

2.將0.01%的氯金酸溶液100ml置于干凈的燒杯或錐形瓶中，在液面處做好標記，在磁力攪拌器上加熱并快速攪拌，待初沸，一次性快速加入1%的檸檬酸三鈉溶液1ml（加液的工具比如槍頭、注射器等要清潔），持續攪拌。

3.接下來就是等，雖然還原及成核反應很迅速，但整個過程相對比較漫長，可以觀察到明顯的顏色變化，黃（氯金酸顏色）→灰黑（渾濁）→紅（透亮），大概的趨勢是這樣的。變透亮的紅色后可以停止加熱，適當低速攪拌幾分鐘，之后放到一邊冷卻。

4.待冷卻后補水至標記處，避光待用。無需過濾，常溫和冷藏存放均可，不可冷凍。

1.器皿：因為膠體金有潔癖，所以器皿需要徹底清潔，可以泡酸，玻璃洗滌劑+超聲也行，最好別用含表面活性劑的洗滌靈。這也是標記時推薦用玻璃瓶的原因，ep管很不干凈，又容易產生吸附。早期的論壇帖子都說為了防止玻璃器皿吸附膠體金，要硅化處理，硅化試劑有毒，咱們只是燒燒金子，又不是搶黃金，沒必要把小命搭上，如果怕膠體金吸附在玻璃器皿壁上，可以固定容器燒金，相當于用膠體金代替硅化。

2.原料：氯金酸特別容易吸潮，吸潮后雖說也可以用，但是因為水份的存在，稱量就不準了，所以最好將1g氯金酸直接配制成1%的溶液100ml，再分到小的ep管里，可以-20℃避光凍存，純化學物質，凍存主要是防止污染和長菌。如果少量稱量的話，要注意氯金酸對金屬有腐蝕性，所以要用塑料藥匙，他特別吸潮，所以直接用容器稱量而不要用稱量紙，1%氯金酸溶液就是1g氯金酸+99ml水（可以等比例變化），不用管他的純度、結合水、金含量等，就是氯金酸直接稱重。另外需要注意的是，不同廠家氯金酸，相同配比燒出來的金子大小會有差異。

3.水：之前講過鹽離子對膠體金穩定性有破壞作用，因此最好用18.2兆歐水（電子行業所稱的超純水），沒有這種制水設備的話用三蒸水，實在不行的話，據說也可以用娃哈哈純凈水。

4.加熱工具：制備膠體金，溫度在95℃以上即可反應，一般控制在100℃左右，過高的溫度可能導至加熱接觸點的膠體金脫水死金，最終會在膠體金溶液表面漂一層油狀物（雖說水的溫度是100℃，但加熱的接觸點溫度會很高）。常用的加熱磁力攪拌器、加熱套、電爐、微波爐等。出于控溫的考慮和攪拌的要求，少量研發推薦用加熱磁力攪拌器。

5.加液順序：有上述加完氯金酸加熱，沸騰后再加檸檬酸三鈉的，也有先煮水，沸騰后再加氯金酸，之后再加檸檬酸三鈉的，還有先加檸檬酸三鈉再加氯金酸的，感興趣的可以都嘗試一下。不管哪一種加液順序，都要求迅速加入、迅速混勻。

6.攪拌和控溫：前面反應原理中提過，這個反應非常迅速，而想獲得均一的膠體金顆粒，初始反應時，需要液體中試劑充分分散均勻、且各點反應溫度相同、且同時發生反應，這樣所有的晶核將在瞬間同時形成，最終形成的膠體金顆粒將具有同樣的粒徑。說起來容易做起來難，但這至少指明攪拌和控溫在膠體金制備中有很重要的影響，尤其在大量煮金的時候，液柱高度、沸騰程度、加液時機、加液順序和方式、反應溫度、攪拌速度等等都需要研究優化。

7.補水：加熱沸騰必然會流失一部分水，我們可以采用上面的做標記最后補水的措施，也可以在瓶口蓋塊玻璃片防止水蒸氣流失。

8.膠體金的Ph：制備好的膠體金Ph在5、6左右，大顆粒的金因為氯金酸比例相對高，Ph會稍微低一些。因為膠體金會吸附Ph計電極，不建議用Ph計測，又因為Ph試紙本身就不太準，膠體金的顏色也會有一些影響，所以也沒必要用試紙測，在標記時也是如此。那為什么還要廢話的提一下Ph呢，這和后面的標記有關，方便理解標記時的現象。

9.主要參考文獻：丁香園早期翻譯的《高質量金溶膠的生產》、丁香園各種帖子、濤哥答疑錄。

1.肉眼觀察：主要評價參數“顏色”，“渾濁與否”，“有沒有漂浮的油狀物（有的話，用槍吸出去就好了）”。

2.分光光度計掃描：通常做法是掃描450-650nm的吸收曲線，然后看3個不靠譜的參數，①最大吸收峰位置對應膠體金粒徑，顆粒越大，最大吸收峰位置越大；②峰寬對應顆粒均勻度，峰形越細顆粒大小越均勻；③最大吸收峰OD值與相對濃度有關。

這三個參數理論上正確，用起來并不理想，以實際經驗說，比如你測BBI的商品化40nm膠體金，他的最大吸收峰在526，半峰寬=42nm，最大吸收值0.94，當你測幾組自己燒的金，最大吸收峰位置一樣是526，但是可能明顯看到這幾組金子顏色不一樣，電鏡結果也顯示這幾組金子的平均直徑分別是30到60nm之間（別笑，這是真實數據），因為最大吸收峰不光與顆粒大小有關，顆粒的形狀也有顯著影響，因此最大吸收峰這個參數并不能準確預測顆粒直徑。再說峰寬，如果你測得峰寬都在50、60，那說明你的金子均一性確實比BBI的差很多，那要是你測出來也是42，甚至40，能說明你的均一性好嗎？結果是否定的，因為這個峰寬跟峰形有很大關系，有聚集的金子，會導至峰形變化，峰寬會很不確定，有可能變大，也可能變低了。最后這個最大吸收峰OD值與在這里產生吸收峰的粒子的相對濃度有關，可以考慮用他控制相同工藝下金標復合物的復溶比例，但是沒法用他橫向比較不同金子。所以最終你可以掃描出一條有模有樣的曲線，但從這個曲線上，你找不到任何控制金子質量的有效方法（至少以上在文獻中出鏡率最高的三個參數不行，其他的有待發現。下圖是峰形對比，紅線為BBI金子，藍線為自制金子，差異雖然比較明顯，但是如何在沒有對照的情況下提煉參數，或者加對照設置參數，讓質控標準可測量化、數值化？偏離到何種程度，體現到產品性能上完全不能接受？）。