1 中性鹽沉淀（鹽析法）
? 在溶液中加入中性鹽使生物大分子沉淀析出的過程稱為“鹽析”。除了蛋白質和酶以外，多肽、多糖和核酸等都可以用鹽析法進行沉淀分離。
? 鹽析法應用最廣的還是在蛋白質領域，已有八十多年的歷史，其突出的優點是：
? ①成本低，不需要特別昂貴的設備。
? ②操作簡單、安全。
? ③對許多生物活性物質具有穩定作用。
? ⑴ 中性鹽沉淀蛋白質的基本原理
? 蛋白質和酶均易溶于水，因為該分子的－COOH、－NH2和－OH都是親水基團，這些基團與極性水分子相互作用形成水化層，包圍于蛋白質分子周圍形成1nm～100nm顆粒的親水膠體，削弱了蛋白質分子之間的作用力，蛋白質分子表面極性基團越多，水化層越厚，蛋白質分子與溶劑分子之間的親和力越大，因而溶解度也越大。親水膠體在水中的穩定因素有兩個：即電荷和水膜。因為中性鹽的親水性大于蛋白質和酶分子的親水性，所以加入大量中性鹽后，奪走了水分子，破壞了水膜，暴露出疏水區域，同時又中和了電荷，破壞了親水膠體，蛋白質分子即形成沉淀。鹽析示意圖如下頁“圖 4”所示。
? ⑵ 中性鹽的選擇
? 常用的中性鹽中最重要的是（NH4）2SO4，因為它與其他常用鹽類相比有十分突出的優點：
? 1) 溶解度大：尤其是在低溫時仍有相當高的溶解度，這是其他鹽類所不具備的。由于酶和各種蛋白質通常是在低溫下穩定，因而鹽析操作也要求在低溫下（0～4℃）進行。由下表可以看到， 硫銨在0℃時的溶解度，遠遠高于其它鹽類：
? 表2-1 幾種鹽在不同溫度下的溶解度（克/100毫升水）
? 0℃ 20℃ 80℃ 100 ℃
（NH4)2SO4 70.6 75.4 95.3 103
? Na2SO4 4.9 18.9 43.3 42.2
? NaH2PO4 1.6 7.8 93.8 101
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? 2) 分離效果好：有的提取液加入適量硫酸銨
鹽析，一步就可以除去75％的雜蛋白，純
度提高了四倍。
? 3) 不易引起變性，有穩定酶與蛋白質結構的
作用。有的酶或蛋白質用2～3mol/L濃度的
（NH4）2SO4保存可達數年之久。
? 4) 價格便宜，廢液不污染環境。
? ⑶ 鹽析的操作方法
? 最常用的是固體硫酸銨加入法。將其研成細粉，在攪拌下緩慢均勻少量多次地加入，接近計劃飽和度時，加鹽的速度更要慢一些，盡量避免局部硫酸銨濃度過大而造成不應有的蛋白質沉淀。鹽析后要在冰浴中放置一段時間，待沉淀完全后再離心與過濾。
? 在低濃度硫酸銨中鹽析可采用離心分離，高濃度硫酸銨常用過濾方法。
? 各種飽和度下需加固體硫酸銨的量可由附錄中查出。
? ⑷ 鹽析曲線的制作
? 如果要分離一種新的蛋白質和酶，沒有文獻數據可以借鑒，則應先確定沉淀該物質的硫酸銨飽和度。具體操作方法如下(講義p39)：
蛋白質量(mg)或酶活力
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 硫銨飽
和度％
? ⑸鹽析的影響因素
? 1) 蛋白質的濃度：高濃度的蛋白質用稍低的硫酸銨飽和度沉淀，若蛋白質濃度過高，易產生各種蛋白質的共沉淀作用。低濃度的蛋白質，共沉淀作用小，但回收率降低。較適中的蛋白質濃度是2.5％～3.0％，相當于25 mg/mL～30mg/mL。
? 2) pH值對鹽析的影響：在等電點處溶解度小，pH值常選在該蛋白質的等電點附近。
? 3) 溫度的影響：對于蛋白質、酶和多肽等生物大分子，在高離子強度溶液中，溫度升高，它們的溶解度反而減小。在低離子強度溶液或純水中蛋白質的溶解度大多數還是隨濃度升高而增加的。一般情況下，可在室溫下進行。但對于某些對溫度敏感的酶，要求在0℃～4℃下操作，以避免活力喪失