盤點：單核苷酸多態性（SNP）檢測方法

　　單核苷酸多態性(Single Nucleotide Polymorphisms, SNP)主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態性，包括堿基的顛換、轉換、插入和缺失。它是人類可遺傳變異中最常見的一種，占所有已知多態性的90%以上。SNP作為第三代分子標記，被廣泛應用于分子遺傳學、法醫物證檢驗以及疾病診斷和治療等眾多領域。

　　一、檢測方法介紹

　　1、測序法

　　Sanger測序是DNA序列分析的經典方法，可直接獲取核酸序列信息，是SNP檢測的“金標準”。而且，Sanger測序可發現未知的 SNP位點，確定SNP 的突變類型和突變位置，是一種無法替代的最直接、最準確的SNP檢測方法。

　　采用測序法檢測SNP時，首先可將含有SNP位點的靶標序列通過PCR擴增形成DNA片段后，再利用Sanger測序獲取目標區域的核酸序列，并對SNP位點進行比對，由此即可確定是否存在變異位點。

　　Sanger測序是基于雙脫氧核糖核苷酸(ddNTP)末端終止的方法進行檢測的。即在四個單獨的反應體系中，分別對應摻入四種帶有不同顏色標記的A、T、G、C雙脫氧核苷酸，使得核苷酸在某一固定點開始延伸反應，而延伸過程中若摻入ddNTP，則由于堿基上無3’-OH導致延伸無法繼續，從而隨機在某一特定堿基處終止，形成相差一個堿基的不同系列長度的核酸片段，再利用毛細管電泳分離這些不同長度的核酸片段，最后通過不同堿基標記的顏色讀取待測核酸的堿基序列，由此獲得目標區域的核苷酸序列。

　　2、TaqMan探針法

　　TaqMan探針是一種雙標記、自淬滅的水解探針，其5’和3’末端分別標記熒光基團和淬滅基團，在探針結構完整時兩者距離較近，熒光基團的信號可被淬滅。而在PCR擴增過程中，若TaqMan探針與靶標序列完全匹配，探針則可結合在DNA模板上，此時Taq酶延伸至探針位置時，其外切酶活性將切割水解探針，釋放熒光基團，使得熒光信號增強。而且，隨著擴增產物的增多，熒光信號越來越強，從而可通過儀器實時監測熒光信號的變化過程。

　　針對雙等位基因SNP，可分別設計兩種對應的探針，只有探針與模板完全匹配時，在擴增擴增過程中探針可被水解產生較強的熒光信號，而如果探針與靶序列之間存在錯配，其熒光強度將會減弱，由此可通過熒光強度檢測SNP位點。

　　而由于MGB探針的長度可以設計得更短，有利于提高探針的識別特異性，因此用于檢測SNP的TaqMan探針常用MGB修飾。但在測試時，需篩選測試較多的探針，探針合成成本相對較高。

　　3、ARMS-PCR法

　　擴增阻滯突變系統PCR(Amplification Refractory Mutation System PCR,ARMS-PCR)，又稱為等位基因特異性PCR(Allele-Specific PCR, AS-PCR)，是基于Taq DNA 聚合酶無法修復引物3’末端的單個堿基錯配，從而使得擴增受阻的檢測方法。在擴增過程中，只有當引物3’末端的堿基與SNP位點的等位基因互補配對時，才能正常延伸擴增；而當引物3’末端的堿基與SNP位點的等位基因不互補配對時，則不發生擴增反應，由此對擴增產物進行凝膠電泳或熒光PCR檢測，則可確定SNP基因型。

　　在ARMS-PCR基礎上也發展出了一些改良方法，如四引物擴增阻滯突變系統 PCR(tetra-primer amplification refractory mutation system PCR, Tetra-primer ARMS-PCR)。該方法設計了四條引物，其中兩條為3’末端位于SNP位點上的內引物，兩條引物方向相反，且分屬于不同基因型；另外兩條為通用外引物，且兩條引物與SNP位點的距離應不一樣。這樣，在反應過程中，若四條引物均與模板完全匹配，則可擴增出三種長度不一的產物(兩條內引物位于同一位點上，無長片段擴增產物形成)；而如果兩條內引物中有一條引物與模板不匹配，則只形成兩種不同長度的產物，因此，根據電泳后產物大小即可判斷基因型。

　　然而，由于凝膠電泳檢測時間較長，而且開蓋進行產物分析易造成污染，因此市面上使用ARMS-PCR方法開發的產品，大部分采用了閉管檢測的實時熒光PCR。ARMS-PCR法的熒光PCR檢測時，同樣使用TaqMan探針，只是將SNP位點設計在引物3’末端，因此理論上只有引物3’端與模板完全匹配時，才能形成擴增曲線；但在實際檢測時，單個堿基的錯配依然可以延伸擴增，只是效率較低。為了提高其特異性，有時需在靠近引物3’末端的位置人為引入錯配堿基，以降低非靶標序列的擴增效率。

　　4、分子信標法

　　分子信標是一段雙標記的寡核苷酸探針，其5’末端和3’末端分別標記熒光基團和淬滅基團，且探針5’端和3’端的部分堿基可互補配對，從而形成莖環結構，使得熒光基團和淬滅基團相互靠近而熒光信號較低。分子信標的環狀結構部分包含SNP檢測位點，當模板與分子信標環狀結構的核酸序列完全匹配時，分子信標可與模板雜交形成伸展狀態，從而導致熒光基團和淬滅基團的空間距離拉大，熒光信號增強，因此可被儀器檢測，并確定SNP位點。

　　而使用不同熒光基團標記分子信標，則可區分SNP類型。該方法與TaqMan探針法類似，均是通過探針中單個堿基的識別能力區分SNP。只是分子信標采用莖環結構，而TaqMan探針使用MGB修飾，以提高探針對SNP的識別特異性。

　　5、高分辨率熔解曲法

　　高分辨熔解曲線分析技術(high-resolution melting analysis, HRM)是通過特定染料與擴增后產物結合后形成特定的熔解峰進行分析檢測的方法，其使用的特料為飽和熒光染料，具有更強的DNA結合能力，且不影響PCR擴增，在DNA解鏈過程中也不會發生重排，使得熔解曲線具有更高的分辨率。

　　核酸片段的固有特性，如DNA序列的長度、GC含量和堿基互補性差異等，均能影響高分辨率熔解曲線，而結合高精度熒光定量PCR儀，其分辨精度則可達到對單個堿基差異的區分，從而可用于確定SNP位點。

　　6、CAPS法

　　酶切擴增多態性序列(Cleaved Amplified Polymorphic Sequence, CAPS)，又稱限制性片段長度多態性聚合酶鏈反應(PCR-RFLP)，是PCR技術與RFLP技術相結合的檢測方法。該方法基于DNA片段在酶切位點上的堿基變異，采用相應的限制性內切酶，對該DNA片段的PCR擴增產物進行酶切，從而產生不同的電泳圖譜，由此確定SNP位點的堿基類型。

　　CAPS僅能檢測位于酶切位點處的SNP，對于酶切位點以外的SNP則無法檢測。為了解決這個不足，對于那些不能采用CAPS檢測的SNP位點，可以使用衍生酶切擴增多態性序列(derived cleaved amplified polymorphic sequence, dCAPS)進行檢測，即通過在引物上引入錯配堿基創造酶切位點，進而實現多態性檢測。

　　7、SNaPshot法

　　SNaPshot是美國應用生物公司(ABI)開發的一種商業技術，是基于熒光標記的單堿基延伸原理，而建立起來的分型技術，該方法也被稱為小測序。其引物設計的關鍵是延伸引物的3’末端應緊挨著SNP位點，同時對不同SNP位點可設計不同長度的延伸引物，這樣便可通過引物長度區分SNP位點。

　　檢測時，在一個含有測序酶和四種熒光標記的ddNTP體系中進行多重PCR擴增，由于加入的核苷酸為雙脫氧核糖核苷酸，因此引物延伸一個堿基即終止，其延伸產物通過測序儀檢測，根據峰移動的位置可確定延伸產物對應的SNP位點，而根據峰的顏色則可確定SNP位點的堿基種類。

　　8、KASP法

　　KASP(Kompetitive Allele-Specific PCR)是基于引物末端堿基的特異性匹配對SNP進行檢測的方法，該方法在引物和探針設計上與常規熒光PCR不同，首先需針對SNP的等位基因設計兩條對應的上游引物，引物3’末端分別位于各自的SNP位點上，同時引物5’端各自帶有一段獨特的標簽序列，而下游引物則是一條常規設計共用的引物；其次，設計兩條與上游引物標簽序列一致的熒光探針，探針的5’端分別標記不同的熒光基團，同時對應于熒光探針設計各自互補配對的淬滅探針，并在淬滅探針的3’端標記淬滅基團。由此，在擴增未開始時，熒光探針與淬滅探針結合，熒光基團與淬滅基團相互靠近，而無法產生熒光信號。當設計的上游引物中有一條或兩條與模板完全匹配時，則可啟動擴增，其擴增產物再結合下游引物進行擴增，則形成含有標簽序列的DNA片段；該帶有標簽序列的DNA片段可與熒光探針結合，而熒光探針3’端可作為引物啟動擴增，最后形成帶有熒光標記的擴增產物，而且熒光探針對應的淬滅探針則在擴增過程中被切割掉，從而使得擴增過程的熒光信號增強，可對SNP位點進行檢測。

　　KASP法針對上游引物標簽序列合成了兩個通用熒光探針和兩個通用淬滅探針，再結合不同SNP位點的特異性引物，則可對多個SNP位點進行檢測。

　　9、基因芯片法

　　基因芯片(gene chip)是指將大量針對SNP的寡核苷酸探針高密度地固定在一固相支持物表面，從而形成多重寡核苷酸微陣列，而經熒光染料標記后的待測DNA片段，與芯片上固定好的探針陣列進行雜交反應，核酸片段只與其序列完全互補配對的探針雜交，不與含有單個錯配堿基的序列雜交，從而將目標序列固定下來，再通過清洗去除非目標片段，最后通過掃描檢測芯片上的熒光信號，由此確定SNP位點。

　　另外，也可將寡核苷酸引物的5’末端固定在固相支持物上, 而讓其3’末端作為引物進行延伸反應，且反應體系中使用ddNTP作為原料，因此只能延伸1個堿基, 這個被延伸的堿基與SNP位點堿基互補結合, 由此可通過檢測芯片上的熒光信號確定SNP位點。

　　基因芯片法的檢測通量高，可實現自動化，市面上已有多家企業可銷售SNP芯片，如ThermoFisher、Illumina和Agilent。

　　10、質譜法

　　質譜法是基于基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜技術(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)的檢測方法，其檢測過程中，需通過激光激發DNA分子片段, 再利用飛行時間判斷DNA片段的分子量大小，從而確定SNP位點。其檢測原理同樣使用了單堿基延伸技術，在多重PCR擴增時，其擴增產物將在SNP位點上終止延伸，形成不同分子量的檢測產物，再利用質譜分析獲得圖譜，而不同分子量的延伸產物，在其對應的分子量位置上可查看檢測峰圖，由此確定SNP位點。

　　二、總結

　　用于檢測SNP的方法，除了測序法可直接獲取核酸信息外，其它方法均是基于已知SNP位點進行設計的檢測方法。這些方法中，有些技術在擴增檢測原理上類似。如TaqMan探針法和分子信標法均是基于探針的特異性識別來區分檢測SNP位點的，ARMS-PCR和KASP則是基于引物特異性識別SNP位點的檢測方法，SNaPshot法和質譜法則均使用了單堿基延伸技術。

　　SNP檢測在遺傳疾病的診斷和篩查以及用藥種類和劑量指導等方面有著重要的應用價值。而2019年出現的新型冠狀病毒，作為一種RNA病毒，其在進化演變過程中，也出現了很多SNP位點，其中的一些變異甚至使得新冠的傳染性和毒力存在進一步增強的潛在風險，因而時不時拉響了全球疫情警報。從Alpha、Beta、Mamma到后來的Delta，再到現在的Omicron，面對這些需要關注的變異株(Variants of Concern, VOC)，SNP檢測方法同樣必不可少。