真核細胞表達系統3

由于腺病毒易于培養、純化，宿主范圍廣，故采用該類病毒構建的載體被廣泛應用腺病毒載體的構建依賴于腺病毒穿梭質粒和包裝載體之間的同源重組。但是哺乳動物細胞內的這種同源重組效率很低，利用細菌內同源重組法構建重組體效率會大大提高，即將外源基因插入到腺病毒穿梭質粒中，形成轉移質粒，將其線性化后與腺病毒包裝質粒共轉化大腸埃希菌。另一種方法是通過CrelaxP系統構建重組腺病毒載體，在轉移質粒和包裝質粒中都插入laxP位點，然后將兩個質粒共轉染表達Cre重組酶的哺乳動物細胞，通過Cre介導兩個laxP位點之間的DNA發生重組，可獲得重組腺病毒，這種重組效率比一般的細胞內同源效率高30倍。最近，人們在桿狀病毒中插入巨細胞病毒的啟動子建立了高效的基因轉移載體。由于桿狀病毒是昆蟲病毒，在哺乳動物細胞中不會引起病毒基因的表達，而且載體的構建容易，因而利用桿狀病毒進行基因轉移為我們提供了很好的途徑。

利用哺乳動物細胞表達外源基因時，大多數情況下不需要誘導，但當表達產物對細胞有毒性時應采取誘導，這樣可避免表達產物產生早期就對細胞產生影響。哺乳動物細胞中用到的誘導型載體主要與啟動子有關如熱休克蛋白啟動子可在高溫下被誘導，還有重金屬、糖皮質激素誘導的啟動子。但這些系統存在一些共同的缺陷，如誘導表達特異性差；當系統處于關閉狀態時表達有泄漏誘導劑本身有毒性，常對細胞造成損傷等。
為此，Gossen等構建了受四環素負調節的Tet-on基因表達系統，該系統由調節質粒和反應質粒組成。調節質粒中具有編碼轉錄激活因子 (fIA)的序列，在沒有四環素或強力毒素存在的情況下 tTA可引起下游目的基因表達。隨后Gossen等又對tTA的氨基酸序列進行了改造，構建了受四環素正調節的Tet-on基因表達系統，該系統在沒有四環素的情況下啟動子不被激活，而在加入四環素或強力毒素后目的基因高效表達。四環素誘導的基因表達系統是目前應用最廣泛的哺乳動物細胞誘導表達系統，該系統具有嚴密、高效可控制性強的優點。

外源蛋白的表達會對哺乳動物細胞產生不利影響，因此利用哺乳動物細胞表達外源基因時，一個主要問題便是外源基因不能持久穩定地表達。Mielke等構建了一種能夠在哺乳動物中穩定表達異二聚體蛋白的載體系統，在這個系統中，編碼抗體重鏈和輕鏈的cDNA及嘌呤霉素抗性基因被轉錄成三順反子mRNA。內部的順反子通過內核糖體進入位點(IREs)介導進行翻譯，通過持續選擇壓力，無需繁瑣的篩選過程，便可獲得持久、穩定表達抗體分子的重組體。

哺乳動物細胞表達系統常用的宿主細胞有CHO、COS、BHK、SP2／0、NIH3T3等，不同的宿主細胞對蛋白表達水平和蛋白質的糖基化有不同的影響，因此在選擇宿主細胞時應根據具體情況而定。

利用基因工程技術表達外源蛋白。其產量還不高，難以滿足大規模的實際應用。通過轉基因動物或轉基因植物技術可從動物的乳汁或植物的葉組織中很方便地獲得大量較純的生物活性物質，但目前這項技術還不很成熟，有待進一步研究。

4、結語

目前已經建立了多種誘導表達系統，但它們都有其優點和不足，這就需要我們根據自己的要求選用適當的表達系統。一般來說，一個理想的可誘導表達系統需要符合下述幾個方面的要求。

①特異性：該系統不受其他內源因素的影響，僅能被外源的非毒性藥物所活化。

②非干擾性：該系統成分不能對細胞通路有干擾。

③可誘導性：該系統在非活化狀態下本底活性最低，而在活化狀態下能快速產生高水平的基因表達。

④誘導劑的生物利用率：調節分子能快速滲透人各組織，能通過胎盤屏障及血腦屏障。

⑤可逆性：誘導劑能快速被各組織清除使該系統很快恢復非活化狀態。

⑥劑量依賴性：該系統的反應與誘導劑的濃度成正比，以便進行定性定量分析。

總之，各種表達系統各有其優缺點，酵母和昆蟲細胞表達系統蛋白表達水平高，生產成本低，但它們的加工修飾體系與哺乳動物細胞不完全相同；哺乳動物細胞產生的蛋白質更接近于天然蛋白質，但其表達量低、操作繁瑣。各種表達系統由于翻譯后的加工不完全相同，因而產生的重組蛋白的生物學活性和免疫原性有時會有差別。Van der GeId等利用不同的表達系統表達了蛋白激酶(PR30)，并對它們的抗原性進行了比較，結果發現，在哺乳動物細胞中表達的PR3具有與抗PR3抗體結合的所有表位，在昆蟲細胞中表達的PR3具有大部分表位，而在 甲醇酵母中表達的PR3只具有少數幾個表位。因此，選擇表達系統時，必須充分考慮各種因素，如所需表達的蛋白質性質、實驗條件、生產成本、表達水平、安全性等，權衡利弊后再選擇相應的表達系統。