研究發展出新型三維基因組成像系統

　　4月7日，《細胞研究》發表了中國科學院生物物理研究所劉光慧課題組和徐濤課題組，以及中科院動物研究所曲靜課題組合作的題為Visualization of Aging-Associated Chromatin Alterations with an Engineered TALE System的研究論文（封面故事）。該研究發展了一種新型三維基因組活細胞成像工具TTALE，并利用該系統實現了對端粒縮短和著絲粒構象變化等衰老伴隨的染色質結構改變的精準成像。此外，該研究發現了核仁區核糖體DNA拷貝數減少可以作為人類衰老的新型分子標志物。上述成果為在遺傳和表觀遺傳水平認識人類衰老的本質奠定了基礎。

　　近年來，CRISPR/Cas9和TALE等新型核酸結合蛋白的發現和廣泛應用使得對基因組特定序列的精準成像成為可能。然而，目前基于dCas9和TALE的成像系統尚存在一定的不足：dCas9系統的主要問題是由于其涉及多種蛋白和RNA元件，且dCas9蛋白分子量較大，因而該系統在哺乳動物細胞中瞬時表達存在難度，同時利用該系統成像時細胞核背景噪音也較高；TALE系統盡管蛋白分子量小，并可直接結合DNA，但目前發表的論文，尤其是利用人類細胞進行的基因組成像研究中，很少使用三維熒光原位雜交（3D-FISH）這一“金標準”實驗對TALE成像的精確度進行嚴格確證。

　　在該項研究中，研究人員通過對傳統TALE介導的端粒、著絲粒和核仁區核糖體DNA等基因組重復序列的成像結果進行細致分析，發現利用傳統TALE標記基因組重復序列時會在細胞內產生異常的聚集斑塊，且這些聚集斑塊多數情況下脫離了基因組上的DNA靶序列，因而極大地限制了TALE在染色質三維成像中的應用。研究團隊通過篩選一系列可提高細胞內蛋白溶解性的“助溶解多肽”，發現硫氧還蛋白（Thioredoxin）與TALE的融合表達（該融合蛋白稱為TTALE）能夠特異地清除TALE成像時伴生的聚集斑塊，從而最大程度地釋放TALE在染色質三維成像方面的效能。實驗結果表明，同CRISPR/dCas9系統相比，TTALE具有成像信噪比高及易于操作等優點，可廣泛應用于胚胎干細胞、誘導性多能干細胞、成體干細胞（間充質干細胞和神經干細胞）、終末分化細胞（神經元和血管平滑肌細胞）、腫瘤細胞以及卵細胞等多種人類細胞類型。此外，利用該工具，研究者們首次實現了對28S核糖體DNA的活細胞標記，并揭示28S核糖體DNA主要分布于核仁區的外緣，這將為理解核糖體DNA和核仁在多種生命過程中的功能提供重要的線索和研究工具。

　　人類衰老和許多衰老相關的疾病都伴隨著染色質結構的改變或異常，因此探索染色質結構的動態變化對于深入理解衰老及衰老性疾病的機制具有重要的意義。基因組重復序列是隱含在人類基因組中的“暗物質”，通常被包裹在致密的異染色質中，并且被認為是無用的“垃圾序列”。由于研究手段的限制，在現有的大多數基因組信息分析中，這些“垃圾序列”往往會被主觀地“忽略”掉。人們所熟知的端粒也是一種基因組重復序列，同時端粒的縮短也已經成為衰老研究領域中為數不多的重要分子標志物之一。盡管如此，對于衰老是否伴隨更為廣泛的基因組重復序列的改變，目前人們還知之甚少。研究人員首先利用TTALE系統在培養皿中觀測到了細胞衰老伴隨的端粒縮短和著絲粒異染色質失序等基因組結構的變化，并且首次在體內單細胞水平觀察到了端粒酶缺失小鼠的端粒加速縮短現象。更為重要的是，利用TTALE成像系統，研究團隊發現核仁區核糖體DNA拷貝數的減少可能是人類衰老的生物鐘之一。人類衰老所伴隨的核仁區核糖體DNA拷貝數的減少與端粒的縮短同樣顯著，并且可以便捷地從老年人外周血中檢出，因此可以用作評價人類衰老進程的新型分子標志物。

　　該研究為揭示人類染色質三維結構及其動態變化在衰老和疾病中的作用提供了有力的研究工具。此外，全新人類衰老分子標志物的確立也將為衰老的基礎和轉化研究提供助力。該工作被《細胞研究》遴選為封面文章，同期美國Buck衰老研究所所長Brian K. Kennedy發表Research Highlight，對該工作予以高度評價：（1）“（對于衰老研究領域而言）成功實現對核仁區核糖體DNA的活細胞成像是一項里程碑式的工作。作為基因組不穩定性的重要誘因，核糖體DNA拷貝數的減少可能是真核生物衰老的驅動力之一”；（2）“TTALE系統的應用可能將不只局限于研究人類衰老等生理過程，對于自閉癥和腫瘤等人類疾病的研究，甚至基因治療都將具有潛在價值。”

　　該項工作由生物物理所、動物所、北京大學第三醫院、國家衛計委北京醫院、首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院，以及杭州師范大學等機構合作完成。生物物理所研究員劉光慧、徐濤以及動物所研究員曲靜為共同通訊作者。生物物理所副研究員任若通、博士研究生鄧麗萍以及高級工程師薛艷紅為并列第一作者。該工作受到科技部、自然科學基金委和中科院等項目的資助，相關技術已申請發明專利。