研究揭示翻譯起始前核糖體的雙向掃描過程

　　核糖體準確地識別起始密碼子并起始翻譯是決定生物體內蛋白質穩態的重要機制。前人研究發現真核生物翻譯前起始復合物（Preinitiation complex，PIC，包含核糖體小亞基和多種起始因子）通常從最靠近mRNA的5′帽的AUG起始翻譯。如果在報告基因起始密碼子AUG（annotated AUG，aAUG）的上游插入另一個AUG（upstream AUG，uAUG），則會降低aAUG處的翻譯起始。如果一個AUG沒被PIC識別（被稱為“遺漏”掃描，leaky scanning），核糖體則從其下游（靠近3′端）的一個AUG起始翻譯，以此類推。根據這些現象，科學家提出了著名的“第一AUG法則”。目前研究人員普遍認為PIC嚴格地從5′到3′單向掃描起始密碼子，即“嚴格單向掃描模型”。然而，近年來也有研究人員提出“布朗棘輪雙向掃描模型”理論，認為PIC沿mRNA運動的過程中同時存在5′–3′和3′–5′方向的運動。這兩種模型的主要區別是PIC是否存在3′–5′方向的運動。

　　近日，中國科學院遺傳與發育生物學研究所研究員錢文峰團隊在Genome Biology上發表了題為Distance-dependent inhibition of translation initiation by downstream out-of-frame AUGs is consistent with a Brownian ratchet process of ribosome scanning的論文。該研究發現不對框的下游AUG（downstream AUG，dAUG）可以抑制aAUG的翻譯，但抑制作用隨著aAUG和dAUG之間距離的增加而減弱。這一現象挑戰了“第一AUG法則”和“嚴格單向掃描模型”，提示PIC在掃描mRNA尋找AUG密碼子的過程中，雖然整體上按照5′–3′方向移動，但在局部上是通過一系列小振幅（幾個堿基到十幾個堿基）的5′–3′和3′–5′振蕩掃描實現的。

　　為了探索PIC掃描運動的方向性，研究團隊利用高通量方法構建了雙起始密碼子報告系統，在綠色熒光蛋白的起始密碼子（aAUG）下游30nt范圍內的隨機位置插入一個dAUG。該研究將該雙起始密碼子綠色熒光報告系統導入到酵母基因組，獲得含有13437個突變體的高通量酵母細胞文庫，并通過高通量方法獲取每一種突變體序列對應的蛋白質水平。實驗結果顯示，下游不對框的dAUG會抑制aAUG的翻譯起始，并且隨著aAUG和dAUG之間距離的增加，抑制作用逐漸減弱。這一現象暗示，本來可能可以通過二次掃描識別aAUG的核糖體小亞基被臨近的dAUG“截獲”了，從而影響了aAUG的翻譯起始。因此，PIC掃描過程中存在3′–5′方向的運動，aAUG和臨近dAUG之間存在翻譯起始的競爭，這些現象可以很好地用雙向掃描模型來解釋。

　　根據雙向掃描模型，研究團隊進一步預測臨近的AUG對于翻譯起始的競爭應該不僅存在于aAUG和臨近dAUG之間，也應該存在于aAUG和臨近uAUG之間。即，隨著不對框的uAUG與aAUG之間距離的縮短，uAUG對翻譯的抑制作用將減弱。為了驗證這一預測，研究人員構建了含有15586個突變體的酵母uAUG文庫，發現結果確實與這一模型預期相符。

　　若只考慮PIC在5′–3′和3′–5′方向上的運動，PIC的擴散模型也能解釋目前發現的現象——該模型認為PIC可以通過沿著mRNA進行非ATP依賴的雙向運動“擴散”到起始密碼子的位置。為了區分擴散和布朗棘輪運動兩種模型，研究人員利用實驗獲得的大量突變體的GFP表達量數據，根據隨機游走模型模擬掃描過程，并使用馬爾可夫鏈蒙特卡羅算法估算出PIC掃描過程的運動參數。計算模擬結果支持了PIC掃描過程符合布朗棘輪模型而不是擴散模型，同時發現mRNA上每個堿基平均會被PIC掃描約10次。PIC單次掃描AUG識別的成功概率約為~23%，通過多次掃描，可以實現總體上超過90%的AUG識別成功率。

　　如果PIC沿mRNA的運動符合雙向掃描模型，臨近不對框dATG的存在可能會導致功能蛋白質翻譯效率降低，以及細胞毒性肽合成增多，因此可以影響aATG下游序列的進化。研究人員分析了酵母和人類基因組中aATG下游不對框ATG的基因數量的分布，發現不對框dATG的數量隨著與aATG的距離縮短而逐漸減少，這意味著在進化歷程中存在對臨近不對框dATG的清除選擇。

　　相關研究工作得到國家重點研發計劃、國家自然科學基金委、植物基因組國家重點實驗室的資助。

(A)高通量構建雙起始密碼子突變體文庫；(B)突變體文庫分析揭示不對框的下游ATG（dATG）對翻譯的抑制；(C)酵母基因組中不對框dATG數量隨與aATG距離接近而減少（上圖展示“強”翻譯起始序列的dATG，下圖展示“弱”翻譯起始序列的dATG）。