研究蛋白質與DNA相互作用的主要方法

一、引言

在許多的細胞生命活動中，例如DNA復制、mRNA轉錄與修飾以及病毒的感染等都涉及到DNA與蛋白質之間的相互作用的問題。

重組DNA技術的發展，人們已分離到了許多重要的基因。現在的關鍵問題是需要揭示環境因子及發育信號究竟是如何控制基因的轉錄活性。為此需要：

a、鑒定分析參與基因表達調控的DNA元件；

b、分離并鑒定這些順式元件特異性結合的蛋白質因子；

這些問題的研究都涉及到DNA與蛋白質之間的相互作用。

研究DNA-蛋白質相互作用的實驗方法主要包括：

a、凝膠阻滯實驗； 

b、DNase 1 足跡實驗；

c、甲基化干擾實驗； 

d、體內足跡實驗； 

e、拉下實驗。

二、凝膠阻滯實驗

1 概念

凝膠阻滯實驗（Gel retardation assay），要叫做DNA遷移率變動試驗（DNA mobility shift assay）或條帶阻滯實驗（Band retardation assay）是在八十年代初期出現的用于在體外研究DNA與蛋白質相互作用的一種特殊的凝膠電泳技術。

2 原理

在凝膠電泳中，由于電場的作用，裸露的DNA分子向正電極移動距離的大小是同其分子量的對數成反比。如果某種DNA分子結合上一種特殊的蛋白質，那么由于分子量的加大它在凝膠中的遷移作用便會受到阻滯，于是朝正極移動的距離也就相應的縮短，因而在凝膠中出現滯后的條帶，這就是凝膠阻滯實驗的基本原理。

3  過程

首先制備細胞蛋白質提取物（理論上其中含有某種特殊的轉錄因子）

用放射性同位素標記待檢測的DNA片段（含有轉錄因子的結合位點）

這種被標記的探針DNA同細胞蛋白質提取物一起進行溫育，于是產生DNA-蛋白質復合物

在控制使DNA-蛋白質保持結合狀態的條件下，進行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳

最后進行放射自顯影，分析電泳結果

4、實驗結果的分析：

a、如果有放射性標記的條帶都集中于凝膠的底部，這就表明在細胞提取物中不存在可以同探針DNA相互結合的轉錄因子蛋白質；

b、如果在凝膠的頂部出現放射性標記的條帶，這就表明細胞提取物存在可與探針DNA結合的轉錄因子蛋白質。

5、DNA競爭實驗：

DNA競爭實驗（DNA competitive assay）的具體做法如下：

在DNA-蛋白質結合的反應體系中加入了超量的非標記的競爭DNA（competitor DNA），如果它同探針DNA結合的是同一種轉錄因子蛋白質，那么由于競爭DNA與探針DNA相比是極大超量的，這樣絕大部分轉錄因子蛋白質都會被競爭結合掉，而使探針DNA仍然處于自由的非結合狀態，可以在電泳凝膠的放射自顯影圖片上就不會出現阻滯的條帶；

如果反應體系中加入的競爭DNA并不能同探針DNA競爭結合同一種轉錄因子，結果在電泳凝膠中的放射自顯影圖片上就會出現阻滯的條帶。

6、應用：

a、凝膠阻滯實驗可以用于鑒定在特殊類型細胞蛋白質提取物中，是否存在能同某一特定的DNA（含有轉錄因子結合位點）結合的轉錄因子蛋白質；

b、DNA競爭實驗可以用來檢測轉錄因子蛋白質同DNA結合的精確序列部位；

c、通過競爭DNA中轉錄因子結合位點的堿基突變可以研究此種突變競爭性能及其轉錄因子結合作用的影響；

d、也可以利用DNA同特定轉錄因子的結合作用通過親和層析來分離特定的轉錄因子。

三、足跡實驗

1、定義:

足跡實驗（foot-printing assay），是一種用來檢測被特定轉錄因子蛋白質特異性結合的DNA序列的位置及其核苷酸序列結構的專門實驗方法。

2、原理：

當DNA分子中的某一區段同特異的轉錄因子結合之后便可以得到保護而免受DNaseI 酶的切割作用，而不會產生出相應的切割分子，結果在凝膠電泳放射性自顯影圖片上便出現了一個空白區，俗稱為“足跡”。

3、過程：

將待檢測的雙鏈DNA分子在體外用³²P作5‘末端標記，并用適當的限制性內切酶切出其中的一個末端，于是便得到了一條單鏈末端標記的雙鏈DNA 

在體外同細胞蛋白質提取物（細胞核提取物也可以）混合，形成DNA-蛋白質復合體 

在反應混合物中加入少量的DNase I,并控制用量使之達到平均每條DNA鏈，只發生一次磷酸二酯鍵的斷裂：

a、如果蛋白質提取物中不存在與DNA結合的特定蛋白質，使DNase I消化之后，便會產生出距離放射性標記末端1個核苷酸，2個核苷酸，3個核苷酸------等等一系列前后長度均相差一個核苷酸的不間斷的連續的DNA片段梯度群體；

b、如果DNA分子同蛋白質提取物中的某種轉錄因子結合，被結合部位的DNA就可以得到保護免受DNase I酶的降解作用除去蛋白，加樣在20%序列膠上進行電泳分離，實驗分兩組:

a、實驗組：DNA+蛋白質混合物

b、對照組：只有DNA，未與蛋白質提取物進行溫育

最后進行放射性自顯影，分析實驗結果。

4、結果判斷:

實驗組凝膠電泳顯示的序列，出現空白的區域表明是轉錄因子蛋白質結合部；與對照組序列比較，便可以得出蛋白質結合部位的DNA區段相應的核苷酸序列。

5、其他的足跡實驗方法：

除了DNase1足跡試驗之外，目前還發展出了若干種其他類型的足跡實驗，例如：

a、 自由羥基足跡實驗；b、菲咯啉銅足跡實驗；c、DMS(硫酸二甲酯)足跡實驗

DMS(硫酸二甲酯)足跡實驗的原理

DMS能夠使DNA分子中裸露的鳥嘌呤（G）殘基甲基化，而六氫吡啶又會對甲基化的G殘基作特異性的化學切割。如果DNA分子中某一區段同轉錄因子結合，就可以避免發生G殘基的甲基化而免受六氫吡啶的切割作用。

四、甲基化干擾實驗

1、概念：

甲基化干擾實驗（Methylation interference assay）是根據DMS（硫酸二甲酯）能夠使DNA分子中裸露的鳥嘌呤（G）殘基甲基化，而六氫吡啶又會對甲基化的G殘基作特異性的化學切割這一原理設計的另一種研究蛋白質同DNA相互作用的實驗方法。

應用這種技術可以檢測靶DNA中G殘基的優先甲基化，對爾后的蛋白質結合作用究竟會有什么效應，從而更加詳細的揭示出DNA與蛋白質相互作用的模式。

2、實驗步驟：

用DMS處理靶DNA使之局部甲基化（平均每條DNA只發生一個G堿基甲基化作用）

同細胞蛋白質提取物一起進行溫育，促進使DNA與蛋白質的結合

進行凝膠電泳形成兩種靶DNA條帶：

a、 其一沒有同蛋白質結合的DNA正常電泳條帶

b、其二同特異蛋白質結合而呈現滯后的DNA電泳條帶

將這兩種DNA電泳條帶分別從凝膠中切出，并用六氫吡啶進行切割，結果為：

a、甲基化的G殘基被切割:因為轉錄因子蛋白質只能夠同未發生甲基化的正常的結合位點結合，所以在轉錄因子DNA結合位點序列中的G殘基如果被DMS甲基化之后，轉錄因子就無法同其結合位點（順式元件）發生結合作用，從而使得結合位點中的G殘基同樣也要被六氫吡啶切割；

b、不具有甲基化G殘基的靶DNA 序列則不會被切割

將結合蛋白質的DNA條帶和不結合蛋白質的DNA條帶，經六氫吡啶切割作用之后，再進行凝膠電泳

作放射自顯影，讀片并分析結果

3、結果判斷：

a、同轉錄因子蛋白質結合的靶DNA序列，經六氫吡啶切割之后，電泳分離呈現兩條帶，有一個空白區

b、不同轉錄因子蛋白質結合的靶DNA序列，經六氫吡啶切割后，電泳分離呈現三條帶，沒有空白區域的出現。

4、應用：

a、甲基化干擾實驗可以用來研究轉錄因子與DNA結合位點中的G殘基之間的聯系；

b、是足跡實驗的一種有效的補充手段，可以鑒定足跡實驗中DNA與蛋白質相互作用的精確位置

5、缺點：

DMS只能使DNA序列中的G和A殘基甲基化，而不能使T和C殘基甲基化。

五、體內足跡實驗

上面討論的三種研究轉錄因子與DNA相互作用的方法，有一個共同的不足之處在于它們是在體外進行的實驗，因此人們就會考慮這些實驗結果是否能夠反映細胞內發生的真實生命過程，即細胞內發生的真實的DNA與蛋白質的相互作用情況。

為了解答這個問題，科學家就設計出了一種體內足跡試驗（in vivo foot-printing assay），該方法可以看做是體外DMS足跡實驗的一個變種。1、原理：

體內足跡試驗的原理原則上同體外DMS足跡實驗無本質差別，即

a、DMS能夠使G殘基甲基化；

b、六氫吡啶能特異的切割甲基化的G殘基；

c、同特異轉錄因子蛋白質結合的識別序列中的G殘基由于受到蛋白質的保護而不會被DMS甲基化，于是不會被六氫吡啶切割；

d、同對照的裸露的DNA形成的序列梯作比較，就會發現活細胞DNA形成的序列梯中缺少G殘基沒有被切割的相應條帶。

2、過程：

用有限數量的化學試劑DMS處理完整的游離細胞，使滲透到胞內的DMS濃度恰好導致天然染色體DNA的G殘基發生甲基化

對這些經過DMS處理的細胞提取DNA，并在體外加入六氫吡啶作消化反應

PCR擴增后作凝膠電泳分析，因為在體外實驗中用的是克隆的DNA片段其數量足夠，而在體內足跡實驗中用的是從染色體DNA中分離獲得的任何一種特異的DNA，其數量是微不足道的，所以需要經PCR擴增以獲得足夠數量的特異DNA

放射自顯影，讀片并記錄讀片的結果

3、結果判斷：

a、能夠同轉錄因子蛋白質結合的DNA區段其中G殘基受到保護因而不會被DMS甲基化避免了六氫吡啶的切割作用；

b、體外裸露的DNA分子上，G殘基被DMS甲基化而被六氫吡啶切割。

六、拉下實驗（Pull-down assay）

拉下實驗又叫做蛋白質體外結合實驗（binding assay in vitro），是一種在試管中檢測蛋白質之間相互作用的方法。其基本原理是將某種小肽（例如生物素、6-His標簽以及谷胱甘肽轉移酶等）的編碼基因與誘餌蛋白的編碼基因重組，表達為融合蛋白。分離純化融合蛋白并與磁珠結合，使之固相化之后，再與表達目的蛋白的細胞提取物混合保溫適當時間，例如在4℃下保溫過夜，使目標蛋白同已經固定在磁珠表面的融合蛋白中的誘餌蛋白充分的結合。離心收集與固定化的融合蛋白（即與磁珠相互結合的融合蛋白）中的誘餌蛋白相結合的目的蛋白，經過煮沸處理使目的蛋白與誘餌蛋白相脫離從而從固相支持物（例如磁珠）上脫離下來，收集樣品，再與目標蛋白的抗體作Western blotting分析，以檢測出與誘餌蛋白的目標的目標蛋白。