硝酸還原酶活性的測定

一、原理
硝酸還原酶是植物  氮素作用中的關鍵性酶，與作物吸收和利用N肥有關的不同品種，年齡、器官組織以及環境條件對硝酸還原活性都有影響，硝酸還原酶作用于NO3使還原為NO2
NO3-+NADH+H→NO2- +NAD+H2O
產生的NO2- 可以從組織內滲到外界溶液中，并積累在溶液中因此測定反應溶液中NO2- 的含量的增加，即表明酶活性的大小。
NO2- 含量的測定用對氨基苯磺酸化比色法，亞硝酸對氨基苯磺酸和α-萘胺在酸性條件下生成紅色化合物，顏色在2-3小時穩定，可用比色法定量，該法非常靈敏，能測定每毫升0.5微克的Na NO2。                      
二、儀器和藥品
721型分光光度計  （或其他型號比色計），剪刀，真空泵（或注射器），小天平，溫箱，燒杯，移液管，小燒杯（50ml）
0.2MKNO3：將20、22克KNO3溶于100ml蒸餾水中。
0.1M磷酸緩沖液  （PH=7.5）：將85.2%ml 1/15M磷酸氫二鈉與14.8ml 1/15M磷酸二氫鉀混合均勻。
1/15MNa2HPO4溶液：1000ml中含Na2HPO4?2H2O11.878克。
1/15M溶液：1000ml中含KH2PO49.078克。
對氨基苯磺酸試劑：1克對氨基苯硝酸加加25ml濃HCl，用蒸餾稀釋至100ml.。
α–萘胺試劑，0.2克α–萘胺加25ml濃HCl，用蒸餾稀釋至100ml。
NaNO2標準溶液：1克NaNO2用蒸餾水溶解至1000ml，然后吸取5ml，再加蒸餾水稀釋成1000ml，該溶液每毫升含有NaNO2 5微克，用時稀釋之。
三、實驗步驟：
1、 將新鮮葉片（蓖麻、向日葵、小麥、棉花等），用水沖洗凈，并
用吸水紙吸干，用剪刀剪成小塊(注意塊小為宜)，然后在小天平上稱取等重的兩份葉片，每份約0.5克。分別置于含有下列溶液的小燒杯中。
（1） 1M磷酸緩沖溶液5ml+蒸餾水5ml
（2） 0.1M磷酸緩沖溶液5ml+0.2M KNO35ml
然后將小燒杯置于真空干燥器中，接上真空泵抽氣，放氣后葉片便沉于底部（如沒有真空泵，也可以20ml注射器代替，將反應液及葉片一起倒入注射器使之真空，如此進行抽氣、放氣反復多次，溶液即可滲入葉組織內取代了葉片內的空氣，葉片便沉于溶液底部），取出小燒杯置于30℃溫箱中，使不見光保溫作用30分鐘。
注意取樣前葉子已進行一段時間的光合作用，以積累碳水化合物，如果組織中的碳水化合物含量低，會使酶活性降低，此時可于反應溶液中加入30uM3-磷酸甘油醛或1.6-二磷酸果糖，能顯著增加NO2的產生。
2、NO2含量的測定
保溫30分鐘后，分別吸取反應液1ml于試管中，加入對氨基苯磺酸2ml及α–萘胺2ml混合搖勻，靜置20分鐘生成紅色，用比色計進行比色測定。比色用520nm記下光密度讀數，從標準曲線上查得的含量，然后計算酶活性，以每小時每克鮮重產生的NO2-微克表示。
3、 繪制標準曲線
測定NO2的對氨基比色法很靈敏，可以檢出1ugml的NaNO2含量，故可于0-5ug/ml濃度范圍內繪制標準曲線，注意顯色反應的速度與重氮化作用及偶聯作用的速度有關溫度，酸濃度等都影響顯色溫度，同時也影響靈敏，所以標準與樣品的測定都要在相同的條件下進行。
吸取不同濃度的NaNO2溶液（如5、5、3、1、0.5、0.1ug/mg）1ml于試管中，加入對氨基苯磺酸試劑2ml及α–萘胺試劑2ml，混合均勻，靜置20分鐘（或于一定的溫度的水浴中保溫20分鐘），于比色杯中，在520nm下進行比色，讀取光密度，然后于坐標紙上繪制光密度—濃度曲線，以光密度為縱坐標，NaNO2濃度為橫坐標。