硫氧還原蛋白融合蛋白的表達和純化實驗

融合蛋白

氨芐青霉素 甘油 色氨酸

電泳儀 培養箱 搖床 試管

1.  將編碼目的序列的DNA片段克隆于pTRXFUS或hpTRXFUS質粒上的trxA基因3‘末端，構建符合讀框的融合基因，或者于pALtrxA-781的單一Rsr 2位點上插入短肽編碼序列。

2.  用含有重組硫氧還蛋白融合蛋白的質粒的連接混合液，轉化感受態GI724細胞。轉化的細胞種入含100 μg/ml 氨芐青霉素的IMC培養皿選擇轉化子，把培養皿放在30℃對流培養箱中溫育，直到出現菌落。

3.  候選菌落接種于5 ml CAA/甘油/氨芐青霉素100培養液中于30℃溫育過夜。小量制備質粒DNA，用限制性酶切作圖檢査基因是否正確插入pTRXFUS。

4.  對候選克隆的質粒DNA進行測序，以確證硫氧還蛋白與待研究基因或序列間的連接 區域。

5.  將凍存的含硫氧還蛋白表達質粒的GI724菌劃線接種到含100 μg/ml 氨芐青霉素的IMC培養基上，以長出單菌落。于30℃生長20 h。
 

6.  從平皿中挑取新長起來的、分離較好的菌落，接種18 mm×150 mm 培養管內的5 ml 含100 μg/ml 氨芐青霉素的IMC培養基中。在搖床上于50℃溫育過夜。

7.  取0.5 ml 過夜培養物，接種于250 ml 培養瓶內的50 ml 含100 μg/ml 氨芐青霉素的新鮮IMC培養基中。于30℃充分通氣培養，直到其550 nm 吸收值達到0.4~0.6 OD/ml。

8.  從培養物（未誘導的細胞）中取出1 ml 的一小管。在550 nm 處測量吸收值，當密度達 到0.4~0.6 OD/ml 時，于室溫以最大速度微量離心1 min，收獲細胞。用吸液管小心吸去全部用過的培養基，將細胞團塊保存于-80℃。

9.  立即向剩余的細胞中加入0.5 ml 10 mg/ml 的色氨酸（使終濃度達到100 μg/ml），以誘導P_L的轉錄。

10.  37℃溫育4 h。在此期間，每間隔1小時取出1 ml 的小份培養物，按步驟8收獲細胞。

11.  誘導后4 h，于4℃以3 000 r/min 離心（例如，使用Becjman J6轉子）10 min，從培養物中收獲剩余的細胞。于-80℃保存細胞面塊。

12.  用SDS-PAGE樣品緩沖液重懸誘導期間得到的細胞團塊（得自歩驟8和10），加量為200 μl/OD₅₅₀細胞。于70℃加熱5 min，以完全裂解細胞并使蛋白質變性。 
 

13.  在SDS-聚丙烯酰胺凝膠上，每條泳道加入相當于0.15 OD₆₅₀細胞的樣品，凝膠用考馬斯亮藍染色1 h。使凝膠脫色，檢查表達情況。