科研家提出環形RNA全長轉錄本解析技術

近日，中國科學院北京生命科學研究院趙方慶團隊在《自然-實驗手冊》（Nature Protocols）上，發表了題為Full-length circular RNA profiling by nanopore sequencing with CIRI-long的研究論文，建立了環形RNA全長轉錄本解析和高效挖掘的技術體系。

近年的研究表明，環形RNA在真核生物體內具有廣泛的生物學功能。環形RNA序列與線性RNA相似度高，因此如何高效鑒定環形RNA特有的外顯子結構，是環形RNA研究中的重要問題。針對這一問題，趙方慶團隊前期提出了CIRI-AS算法（基于BSJ讀段對比結果對環形RNA內部可變剪接結構進行識別）。后續研究開發了CIRI-full算法（通過識別雙端250bp測序數據中反向重疊區特征，對500bp以內的環形RNA進行全長重構）。由于上述方法主要基于短讀長測序技術，難以對長度500bp以上的環形RNA的全長序列進行有效識別。在此基礎上，研究組開發了基于納米孔測序的環形RNA全長測定方法CIRI-long，實現了對不同長度環形RNA全長結構的高效鑒定。

該研究利用小鼠腦組織及人HeLa細胞系樣本作為示例，闡釋了環形RNA高效富集與全長測定方法：利用核糖體RNA去除試劑盒與改進的RNase R處理流程，消化RNA樣本中的核糖體RNA與其余線性RNA分子，對環形RNA進行初步富集；利用隨機引物逆轉錄與PCR擴增，構建cDNA文庫。在該過程中，環形RNA模板可以發生滾環逆轉錄，產生含有多個環形RNA全長序列的嵌合體cDNA，而來自線性RNA的cDNA產物長度較短。因此，后續流程中使用了片段篩選策略，對環形RNA來源的cDNA片段進行了進一步富集，從而有效提升了文庫中環形RNA來源片段所占比例。該工作利用長讀長納米孔測序技術進行cDNA分子的全長測定，并使用該團隊開發的CIRI-long算法對測序數據中的環形RNA序列進行識別與錯誤校正，從而獲得高置信度的環形RNA全長結構。

前期研究觀察到使用具有模板切換活性的逆轉錄酶，可以在滾環逆轉錄產生的cDNA末端直接引入PCR引物序列，從而實現對低起始量環形RNA的高效捕獲（圖1）。然而，該活性依賴5’ RNA線性末端參與，因此不含5’與3’線性末端的環形RNA如何發生模板切換的原理尚未明確。該工作進一步利用體外轉錄構建的模式環形RNA探究滾環逆轉錄過程發現，經過逆轉錄后，大部分環形RNA模板發生了水解，從而提供了模板切換所需的線性5’末端。同時，在不加入逆轉錄酶的對照組中，環形RNA均保持了完整的環狀結構。這提示環形RNA滾環反轉錄中的模板切換主要依賴RNA模板的線性化水解，為CIRI-long流程提供了重要的理論支持。

同時，該研究總結了CIRI-long方法的應用，提出了CIRI-long方法可為新型環形RNA如線粒體來源環形RNA或內含子自連型環形RNA的存在提供有力的支持證據。同時，重構獲得的環形RNA全長序列可用于后續環形RNA的功能預測（如miRNA或RBP結合位點分析）。此外，利用長讀長測序方法構建出的環形RNA序列，可作為評估基于傳統二代測序技術的環形RNA拼接算法的標準數據集，為現有算法的改進提供指導方向。與近年開發的多個長讀長環形RNA測序技術相比，CIRI-long方法實驗步驟更為便捷，同時可實現對不同長度環形RNA全長結構的直接測定，可應用于多種組織與細胞樣本，頗具應用前景。