第二章：4分鐘教你學會多重PCR引物設計

多元 PCR (多重PCR，Multiplex PCR，MPCR) 是指在一個 PCR 反應中使用一個模板和幾對引物同時擴增多個目的片段的 PCR 反應。這項技術非常有用，他不僅可以提高 PCR 的產率還能提高 DNA 樣品的利用率。

另一種形式的 MPCR 是組合 PCR, 組合 PCR 是在同一 PCR 反應中使用幾個不同的模板和幾對引物。多元 PCR 和組合 PCR 往往被當作同義詞使用。

設計策略

MPCR 要求所有的引物對在同一條件下擴增其各自的特異序列。大多數多元 PCR 反應 局限于擴增 5~10 個目的片段，原因之一是反應中，每另加入一對引物會導致一定程度的靈活性的丟失。引物數量的增加也使引物二聚體和非特異擴增出現的概率增加。因此，進行多元 PCR 要求周密計劃，且需多次嘗試，使反應條件優化。

理論上，一個多元反應中，所有引物擴增其特異序列的效率應該是一樣的，但通常是很難預測一對引物的效率。在相似條件下，退火溫度幾乎相同的寡核苷酸可更好地工作。

多元 PCR 引物設計和優化的一般規律

當設計 MPCR 引物時，除了引物設計的一般規律外，其他一些因素也必須考慮。一般 來說，一個多元反應中使用的所有引物的 Tm 值應該接近，要避免 3'-核苷酸互補，每一對引物應獨立地優化其反應條件。一旦將引物集中，需按順序混合，然后再進行優化。

1. 引物長度應為 18~24 個堿基，較長的引物更容易形成引物二聚體。

2. 對于 MPCR，退火溫度和循環數非常關鍵。要盡可能提髙退火溫度，要確認每一對 引物單獨擴增時的退火溫度，然后在多元 PCR 反應時采用最低的退火溫度。同樣，要采用最少的擴增數。

3. 由于多個模板同時擴增，酶量和核苷酸濃度可能成為限制因子，而且完全合成所有 產物所需的時間增加。因此，優化每個反應的試劑濃度和延伸時間就顯得非常重要。相對于 單個目的序列的 PCR 而言，多元 PCR 所需延伸時間較長。