類朊蛋白鑒定——淀粉樣組裝的磷酸酶介導果蠅胚胎發育

　　類朊蛋白（Prion-like proteins）是指細胞內能夠以自身為模板，聚合成為淀粉樣高聚物（amyloid-like aggregates）的正常蛋白。一般地，氨基酸序列決定了一個蛋白質只存在一種穩定的構象，但類朊蛋白存在可溶性單體和淀粉樣高聚體兩種穩定構象，從而激起科研界廣泛的興趣。類朊蛋白一般都含有Prd（prion-like domain）功能域，以介導蛋白構象的改變【1】。早期，限于朊蛋白疾病的研究，人們普遍認為蛋白的淀粉樣聚合是一種病理狀態。越來越多的研究表明，生理狀態下也存在淀粉樣聚合蛋白，并且發揮重要的調控作用。

　　酵母的朊蛋白[PSI+]具有表觀遺傳的特性，它調控翻譯終止的準確性，從而表達通常隱藏翻譯的部分蛋白，幫助酵母在多變的環境中生存【2】。多細胞真核生物中，第一個被揭示具有生理功能的類朊蛋白是由本篇文章作者Kausik Si團隊報道的CPEB蛋白，淀粉樣聚合使蛋白更穩定從而介導海兔長期記憶的形成【3】。在抗病毒免疫過程中發揮重要作用的MAVS蛋白，受到病毒刺激后，可在線粒體表面聚合成淀粉樣的纖維結構，從而發揮放大抗病毒信號的作用【4】。

　　而生物信息學分析表明，真核生物蛋白組中具有Prd功能域的蛋白廣泛存在而且涉及到多種功能【5】，但絕大多數缺少明確的實驗證據。因此，鑒定新的類朊蛋白并確定其功能對于理解淀粉樣組裝和功能的關系具有重要意義。

　　近日，來自美國密蘇里州斯托瓦斯醫學研究所的Kausik Si團隊在Cell雜志上發表文章——Amyloid-like Assembly Activates a Phosphatase inthe Developing Drosophila Embryo。文章介紹了一種新型的在果蠅胚胎發育過程中重要的磷酸酶Herzog（CG5830），它自身可發生淀粉樣組裝進而激活磷酸酶活性。

　　為鑒定果蠅的類朊病毒蛋白，作者結合信息學分析——PLAAC，SEG和FoldIndex，和多種體外實驗——熒光漂白恢復技術（fluorescence recovery after photobleaching, FRAP），熒光共振能量轉移（Forster resonance energy transfer, FRET），半變性瓊脂糖凝膠電泳技術（semi-denaturing detergent agarose gelelectrophoresis, SDD-AGE），傅里葉紅外變換光譜分析（Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR），篩選到5個類朊病毒蛋白：Herzog（Hzg），Hr4，Psq，CG42540和Mura。作者選取了Hzg進行對類淀粉樣聚合與功能間關系的研究。

　　為證明Hzg在體內發生淀粉樣聚合，作者將Hzg與eGFP融合表達，發現膜蛋白Hzg在胚胎發育到原腸胚時期（產卵后3-3.5 h）開始出現熒光亮點并持續到發育后期。作者對原腸胚時期的Hzg蛋白進行分析，發現大分子聚合態的Hzg蛋白不斷增多。同時使用淀粉樣蛋白特異染料Thioflavin T （ThT）染色，證明Hzg在體內發生高分子聚合。

　　接著，作者通過截短不同功能域發現，N端Prd結構域介導了Hzg的膜定位以及淀粉樣聚合。并且通過質譜和免疫共沉淀鑒定Hzg的靶標蛋白：Babo，Dah，Irk1，Pch2，Ras64B，Src64B，Sax。推測Hzg在這些蛋白介導的TGF-β/BMP和EGF/FGF信號通路中可能發揮作用。

　　進一步，作者發現Hzg N端的Prd功能域為Hzg活性所必需，并且免疫共沉淀實驗排除了N端區域底物Dah識別的作用，而將N端結構域置換為能夠膜定位但不能形成淀粉樣高聚物的CAAX基序，或者能組裝但不能膜定位的CPEB的Prd功能域都導致Hzg功能的喪失，這表明Hzg的膜定位以及淀粉樣組裝都是活性實現的必需條件。

　　而為確定淀粉樣聚合是否直接影響Hzg的磷酸酶活性，作者從體內純化了單體和聚合體兩種形式的Hzg并進行體外實驗。聚合體形式的Hzg活性顯著強于相同濃度的單體形式，也顯著強于同濃度下喪失聚合能力和喪失磷酸酶活性的Hzg突變體。并且，通過變性純化后，在復性過程中使用淀粉樣組裝抑制劑epigallocatechin gallate (EGCG)處理也顯著降低了Hzg的磷酸酶活性，這表明Hzg單體通過聚合組裝能夠增強磷酸酶活性。

　　最后，為確定Hzg在果蠅胚胎發育過程中的功能，作者構建了表達Hzg三個不同截短的突變體，hzgP69，hzgC91和hcgN169，其中hzgP69和hzgC91只包含完整的N端Prd結構域，而hcgN169包含N端Prd和中間的FCP磷酸酶結構域。結果發現純合的hzgP69和hzgC91 F1代無明顯變化，但F2代在產卵后13h導致胚胎死亡，伴隨著胚帶收縮，頭部內卷，背向閉合的缺陷。而hcgN169純合突變繁殖多帶均發育正常。這表明Hzg在胚胎發育過程中發揮重要作用。

　　綜上，作者發現果蠅的Hzg是一種膜定位的prion-like蛋白，它在原腸胚期發生淀粉樣組裝，并且組裝會增強Hzg的磷酸酶活性，進而在果蠅胚胎發育過程中發揮作用。這一發現加深了對于Prd功能域介導的蛋白淀粉樣組裝調控蛋白質功能的理解。

　　原文鏈接：

　　https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.08.019

　　參考文獻

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