紫外可見分光光度計在食品酶分析中的應用

紫外可見分光光度法測定酶活：

　　1. β一半乳糖苷酶

　　β一半乳糖苷酶，又稱乳糖酶(Lactase)。能水解乳糖來降低乳制品的乳糖含量，從而提高乳制品的可消化性，用于低乳糖牛奶和非結晶型濃縮牛奶的生產及奶酪風味的改變，同時還可用于生產低聚半乳糖。

　　【酶活測定】以ONPG為底物測定β-半乳糖苷酶活力。

　　【酶活定義】以ONPG為底物，37℃保溫酶解，每分鐘釋放lμmol/L鄰硝基酚的酶量，定義為1個酶活力單位。

　　2. 超氧化物歧化酶

　　超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，簡稱SOD)是一種十分重要的生物體防止氧化損傷的酶類，是生物體內超氧陰離子清除劑，保護細胞免受損傷。SOD廣泛存在于各類生物體內，所有好氧微生物細胞中都含有SOD。自1969年Mccord等人首次發現了SOD生物活性后，醫學界對其醫療作用做了許多研究，證明它具有抗衰老、抗腫瘤、抗輻射、抗缺血、提高人體免疫力等作用，被專家稱為21世紀最有前途的藥用酶。歐美國家已開始將其應用于醫療、食品、保健、化妝品等領域。

　　【酶活測定】在25℃ 4.5ml 50mmol/L pH8.3的K2HPO4- KH2PO4緩沖液中加入待測SOD樣液，再加入10ul 50mmol/L的連苯三酚，迅速搖勻，倒人光徑lcm 的比色杯，在325nm波長下每隔30s測一次A值。同時測定Sigma公司的SOD標準品，對所測樣品SOD活性進行校正。

　　【酶活定義】在lml反應液中，每分鐘抑制連苯三酚自氧化速率達50%時的酶量為一個酶活單位， 即325nm 0.035OD/min為一個酶活單位。

　　3. 多酚氧化酶

　　多酚氧化酶(PPO)是一類由核基因編碼在細胞質中合成的含銅質體的金屬酶，其作用機理在于銅的氧化-還原作用。大麥中的多酚物質經過PPO的催化氧化后，具有單寧性質，易和蛋白質起交聯作用而沉淀出來，進而影響啤酒的色澤、泡沫、風味和非生物穩定性。大麥中部分PPO以“潛伏”狀態存在，在浸麥過程中，可通過去除一些酶抑制劑、蛋白酶作用或其他的一些方式使其活性在浸麥過程中提高。在大麥發芽過程中，PPO的活力較高，影響著麥芽的質量。因此，在制麥過程中應該降低PPO活性。

　　【酶活測定】0.1mL酶液與lmL 0.1 mol/L鄰苯二酚(用pH 8.4檸檬酸-磷酸緩沖液配制)80oC反應3min，用2mL 20%TCA終止反應，于波長450nm處用分光光度計測定吸收值。

　　【酶活定義】上述條件下，將每分鐘OD值增加0.01定義為1個酶活力單位。

　　4. 葡萄糖氧化酶

　　上世紀60年代以前，葡萄糖氧化酶主要用于蛋品加工業，除去葡萄糖，防止發生Maillard反應，穩定產品質量，延長保質期。80年代末，又陸續開發了去除啤酒溶解氧和瓶頸氧改善風味延長保質期、果汁果酒除氧護色穩定質量、面粉品質改善、海產品和肉類保鮮、飼料添加去氧平衡畜禽胃腸代謝等用途，并建立了葡萄糖氧化酶專業生產車間。

　　【酶活測定】采用-聯(二)茴香胺分光光度法。在有氧存在條件下，葡萄糖氧化酶催化葡萄糖脫氫產生H2O2，在過氧化物酶(POD)作用下，氧供體即鄰一聯(二)茴香胺(DH2)被氧化成棕色產物。于436nm處測量吸光率的變化，即可換算為葡萄糖氧化酶的活性。

　　【酶活定義】一個酶活性單位定義為在26℃下每分催化釋放一微克分子H2O2所需的酶量。

　　5. 果膠酶

　　果膠酶可以改善葡萄酒的色澤、增加酒香，并提高葡萄酒出汁率等，對提高紅葡萄酒的品質有重要作用。

　　【酶活測定】向具塞試管中加入1.8mL 0.30% 聚半乳糖醛酸溶液(用0.05 mol/L Na2CO3/NaHCO3緩沖溶液配制，調節pH 10.0)，于55℃水浴下保溫5 min，然后加入一定稀釋倍數的酶液0.2 mL反應15 min，加入DNS試劑1.5 mL，混勻，在沸水中加熱10min，立即用自來水冷卻，再加入21.5 mL蒸餾水，混勻，于分光光度計上520 nm測定吸光度。空白用煮沸失活的酶液代替。

　　【酶活定義】在上述試驗條件下，以每分鐘分解底物產生1μmol半乳糖醛酸所需的酶量為1個酶活力單位。

　　6. 胰α-淀粉酶

　　【酶活測定】用移液管將0.5 mL酶溶液移入試管，并在水浴中調溫至25℃。加0.5 mL已同樣預熱到25℃的1%淀粉溶液。3 min后加1.0 mL DNS顯色劑。置試管于沸水中5 min，冷卻后用10 mL蒸餾水稀釋。用分光光度計于540 nm處以空白作對照測定吸光度。以0.5 mL磷酸鹽緩沖液代替酶液測定空白值。

　　7. 植酸酶

　　【酶活測定】 以植酸鈉為底物，采用釩鉬酸銨法測定植酸酶的酶活。吸取1 mmol/l的植酸鈉(酶作用底物，用0.25 mol/l、pH值5.50醋酸-醋酸鈉緩沖液配制)1.0 ml，37 oC預熱5 min后，準確加入適當稀釋的酶液0.5 ml(對照組先加反應終止液)，37 oC水浴反應30min后，再加入4 ml反應終止液(現用現配)冷卻至室溫，在415 nm處測定OD值，利用無機磷標準曲線計算出酶活。

　　【酶活定義】在37℃，每分鐘從1 mmol/l植酸鈉溶液中(用pH值5.5的醋酸-醋酸鈉緩沖液配制)釋放出1 nmol無機磷所需要的酶量為一個酶活單位。

　　8. 羧甲基纖維素酶

　　【酶活測定】在0.5mL適當稀釋的酶液中加入質量分數為0.625%的羧甲基纖維素鈉溶液，于50℃水浴中保溫30min，加2.0 mL質量分數為10%的NaOH溶液終止反應，再加入2.5mLDNS試劑，于沸水浴中煮沸15min，冷卻，在550 nm波長處比色，要求光密度讀數盡可能在標準曲線的0. 5 mg葡萄糖處。每次測定均設立空白對照，對照管先加入0.5mL酶液，然后加入2. 0 mL質量分數為10%的NaOH溶液將酶滅活，再依次加入質量分數為0.625%的底物2. 0 mL，與待測管一起保溫，加入DNS，煮沸、冷卻、稀釋比色、與標準曲線對照。

　【酶活定義】在上述條件下，每30min產生0.5mg還原糖為1個Cx活力單位，即每1 h產生1.0mg還原糖為1個Cx活力單位。

　　9. 木聚糖酶

　　木聚糖酶能水解不可溶戊聚糖(阿拉伯木聚糖)，使其成為水溶性的，水解率達65%。面粉中增加水溶性阿拉伯木聚糖，能提高面團的持水性和機械強度，使面團具有更好的持氣能力和操作耐力，進而提高饅頭和面包的品質。

　　【酶活測定】以木聚糖為底物，用DNS法測定還原糖的生成量。取稀釋酶液0.1ml，加1%木聚糖液0.9ml，置50℃水浴保溫30min后，加DNS 2ml于沸水浴中顯色3min，用自來水冷卻后，加蒸餾水定容25ml，測O.D值。

　　【酶活定義】每毫升酶液每分鐘水解木聚糖生成1μmol木糖所相當的酶量。

　10. 蛋白酶

　　【測定原理】中性蛋白酶在一定的溫度和pH條件下,水解酪素底物產生含有酚基的氨基酸,在堿性條件下,將福林試劑還原,生成鉬藍與鎢藍,其顏色深淺與酚基氨基酸含量成正比。通過在660 nm測定其吸光度,可得到酶解產生的酚基氨基酸的量,計算出蛋白酶活力,以此代表蛋白酶的總酶活力。

　　【酶活測定】取3支試管(一支空白管,兩支樣品管),分別向3支試管中準確加入稀釋好的待測酶液1.0 mL,將3支試管放入40℃水浴中預熱5 min,同時將測定底物(1%酪素)置同一溫度水浴中預熱5 min。分別向兩只樣品管中加入1%酪素溶液1.0 mL,準確計時,反應10 min取出。迅速準確向兩只樣品管加入0.4 mol/L三氯乙酸2mL,于空白管中加入0.4 mol/L三氯乙酸2 mL和1.0 mL 1%酪素溶液,搖勻。3支試管中反應液用濾紙過濾。另取3支試管,分別吸取上述相應濾出液1.0 mL,0.4 mol/L碳酸鈉溶液5.0 mL和稀福林試劑1.0 mL,搖勻,置40℃水浴中放置20 min(顯色),取出,迅速冷卻置室溫。以空白管調儀器零點,在分光光度計波長660 nm處分別測兩支樣品管吸光度,取平均值。通過查標準曲線求出生成酪氨酸的含量。

　　11. α-淀粉酶

　　α-淀粉酶是第一個應用于面包制作的微生物酶，它取代了麥芽是由于麥芽中的淀粉酶含量不穩定而且含有蛋白水解酶。

　　【酶活測定】在10 mL 試管中依次加入0. 5%可溶性淀粉溶液1 mL , pH 4. 2的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液2. 5 mL, 40 ℃預熱10 min。然后加入多倍稀釋的0. 5 mL 酶液, 40 ℃保溫5 min后,加入0. 1 mol/L H2 SO4 1 mL 終止反應。再取2 mL 反應液與0. 5% KI - I2 溶液0. 5 mL顯色,測定OD620。與淀粉梯度標準曲線對照得反應液淀粉濃度后,計算酶活力。

　　【酶活定義】在pH 4. 2、溫度40 ℃下, 5 min水解可溶性淀粉1 mg所需的酶量為一個酶活力單位 。

　　12. 脂肪酶

　　利用脂肪酶作用后釋放出的鏈較短的脂肪酸，增加和改進食品的風味和香味;利用脂肪酶催化的醇解和酯化反應來生產各種香精酯，作調料劑;用有專一性的微生物脂肪酶提高食用油營養價值和增加食用油的花色品種，制備代可可酯等高檔油脂;另外，脂肪酶還可以用于酒類的去濁除渣、改善面包質量、改善蛋白的發泡等方面。

　　【酶活定義】在40℃、pH 7.5，以每分鐘從橄欖油中釋放lμmol脂肪酸的酶量定義為一個酶活力單位。

　13. 漆酶

　　【酶活測定】3.0mL反應液中含20 mmol/LABTS 0.7mL，酶液0.lmL和25 mmol/L琥珀酸緩沖液(pH4.5)，在25℃下反應2min后立即用冰浴終止反應，測定436nm處吸光度的增量。

　　14. 木質素過氧化物酶

　　【酶活測定】30℃條件下反應體系中含酶液，濃度為0.2mol/L，且pH值為2.4的酒石酸緩沖液及濃度為0.008mol/L的黎蘆醇各lmL，加人濃度為0.016mol/L的H2O2 lmL 啟動反應，測定反應最初4min內在310nm處的吸光度，以滅過酶活的酶液作對照。

　　15. 錳過氧化物酶

　　【酶活測定】室溫下反應體系中含有50mmol/L pH4.5的乳酸鈉緩沖液3.4mL，1.6mmol/L的MnSO4溶液0.lrnL，酶液0.4rnL，加人1.6 mmol/L的H2O2 0.lmL啟動反應。測定反應最初4min內在240nm處的吸光度。

　　【酶活定義】每分鐘使1μmol的Mn2+轉化成Mn3+所需要的酶量為一個酶活單位。

　　儀器配置

美析公司UV-1500；1800;1900系列紫外-可見分光光度計均可進行食品酶分析。軟件是美析公司研制的專業食品酶分析軟件，具有智能提示功能，可以一步步引導操作員完成酶活測定。即使不是酶分析專家，也能獲得準確、可靠的數據。而且該軟件支持手動輸入模式，即使實驗室使用的是其它品牌的分光光度計。