納米材料在體外診斷技術中的應用（二）

2 納米材料的不同信號模式在體外診斷中的應用

在過去的20多年里，大量的納米材料被開發應用于體外診斷中，納米材料獨特的性能被用來提高傳統體外診斷技術的檢測性能以及開發全新的檢測方法。其中利用納米材料的熒光信號、表面增強拉曼信號、磁信號、電化學信號、顏色信號及熱信號等作為體外診斷的信號檢測模式最具代表性（表1）。

2.1 基于熒光信號的納米體外檢測應用

基于熒光的檢測技術主要用于目標物為核酸或者蛋白的檢測。但是，傳統的熒光染料由于容易光漂白、量子效率不高及較寬的熒光光譜等導至其多指標檢測能力有限。而窄的吸收光譜導至不同的熒光染料需要不同的激光器來激發，因此，半導體量子點常被用來解決傳統熒光染料的這些缺陷。量子點在酶聯免疫吸附實驗（ELISA）免疫檢測和DNA微陣列檢測中可用做報告熒光分子實現化學殘留物和癌癥抗原標志物的單指標或者多指標的檢測（圖3（a）），這個系統檢測肌紅蛋白的檢測限（LOD）可達subattomolar級別。量子點還可以應用于基于能量轉移（FRET）的檢測和多指標檢測（圖3（b、c））。FRET檢測系統利用量子點作為能量給予體，可以將其能量轉移給受體或者猝滅劑，以實現小分子及核酸的檢測，其靈敏度可分別達到10~103 nmol/L及1~103 nmol/L。量子點的多指標檢測能力主要來源于其熒光編碼能力，將不同組合的量子點引入聚合物微球中可以產生不同的熒光編碼。量子點編碼的微球表面可修飾DNA捕獲探針，通過和熒光染料標記的目標DNA雜交后可同時產生編碼信號和檢測信號。研究表明，基于量子點編碼微球的檢測體系已成功實現了多種疾病的生物標志物檢測，靈敏度高達pM級別。此外，在量子點編碼微球表面包覆一層金屬納米殼層可通過金屬增強熒光效應進一步提高其檢測靈敏度（2個數量級），同時還可以獲得更好的微球穩定性。量子點編碼微球檢測體系的多指標檢測能力對于體外檢測技術發展非常有利，可以有效降低多指標檢測過程的人力成本和時間成本。近年來，一些新型納米發光材料也被用于實現體外多指標檢測。

金納米顆粒由于其表面等離子共振效應，可用來淬滅其表面附近熒光染料的熒光。這種淬滅效應可以在較長的距離（約為75 nm）起作用，且依賴于金納米顆粒的形狀和大小。因此，金納米顆粒可用于基于FRET的體外檢測，在檢測過程中，激發態電子的能量以非輻射躍遷的形式從熒光染料分子轉移到納米顆粒。該檢測方法同樣顯示出改善的檢測靈敏度、更好的選擇性以及可同時淬滅多種熒光染料。此外，在金納米顆粒-量子點檢測系統中，量子點同樣可被高效地淬滅，可應用于定量檢測流感病毒的抗原及細胞內的病毒滴度，靈敏度可分別高達100 pmol/L和0.1PFU/mL。與金納米顆粒類似，氧化石墨烯同樣可以淬滅其表面附近熒光染料及量子點的熒光信號。氧化石墨烯可以偶聯染料標記的單鏈DNA探針，并在目標DNA不存在的條件下淬滅其熒光信號，但是在與目標DNA片段結合后，DNA將從石墨烯表面釋放，從而恢復熒光信號。

2.2 基于拉曼信號的納米體外檢測應用

拉曼光譜學是一種通過分析材料的散射光譜獲得材料分子的轉動及振動方面信息，并應用于分子結構研究的分析方法。由于拉曼光譜包含具有多種元素特異性的光譜信號，其光譜的半高寬（FWHM）可窄至1nm，因此這種技術有望應用于多指標檢測。最近研究人員通過調控炔烴的化學結構（苯環數目，C≡C數目，官能團鄰間對位置以及不同的同位素），得到了一系列具有典型的拉曼特征峰的聚炔烴，且光譜很窄，并將其命名為Carbow。通過溶脹法可將10種不同拉曼特征峰的聚炔烴和3個強度水平進行微球編碼，理論上可以得到3¹⁰-1=59048個光譜編碼的超級微球編碼庫（圖4（a））。但是，傳統的拉曼散射通常伴隨著低的吸收截面，大大限制了檢測靈敏度。金屬納米顆粒的表面等離子共振效應可用來增強拉曼信號（圖4（b））。當拉曼分子接近金納米顆粒表面或者處于2個或多個納米顆粒之間的交叉SPR場產生的“熱點”位置時，該信號將大大的增強（可高達1011倍），從而實現高靈敏的單分子檢測。由于其吸收峰面積與濃度相關，因此可用來對目標分子進行定量分析。

產生強的“熱點”，需要精確地控制納米顆粒的形狀，因此制備過程中費時費力。而且表面增強拉曼探針和熱點之間的距離也需要非常嚴格地控制，距離相差幾個納米就有可能在增強信號上相差幾個數量級。這將導至不同探針之間的增強性能差別較大，使定量分析復雜化。基于以上問題的考慮，大部分應用都是基于靈敏度更低的塊體系統而不是單分子的納米系統，其表面拉曼增強效果主要通過將探針固定在溶液體系的金屬納米顆粒表面獲得。目前該技術已經成功用于核酸檢測（10~100 pmol/L LOD）、蛋白檢測（100 pmol/L LOD）、腫瘤細胞檢測、細菌檢測（250 cell/mLLOD）、病毒檢測（100 PFU/mL LOD）及活細胞內小分子藥物的示蹤（100 pmol/L LOD）（圖4）。該技術的主要缺點是探針必須在納米顆粒的表面，限制了納米顆粒的表面化學選擇。此外，表面增強拉曼效應需要高能量激光器激發并且需要貴重的設備類獲得信號，這阻礙了該技術應用于快速檢測應用轉化。

2.3 基于磁性能的納米體外檢測應用

由于磁性納米顆粒在磁場條件下可以分離不同的反應物，因此已經被廣泛應用于生物檢測試劑的開發上。在生物檢測中使用磁性納米顆粒可簡化檢測過程中涉及分離或者洗滌步驟的設計，常規的量子點編碼微球檢測體系可通過在編碼過程中加入磁性納米顆粒，結合磁場和微流控設備實現其自動化檢測，將整個檢測過程簡化（圖5）。磁分離同樣被用在高靈敏度生物編碼檢測技術上，該檢測將磁性納米顆粒和金報告納米顆粒相結合，2種顆粒的表面都修飾了核酸或者蛋白，用來識別和結合目標分析物。結合分析物可將2種顆粒橋接在一起，使得金納米顆粒可隨著磁性納米顆粒通過磁場被分離出來。這樣編碼DNA可從金納米顆粒上釋放出來，最終通過檢測儀檢測出來。

磁性納米顆粒同樣可以直接用作報告探針，通過其產生的磁信號指示目標分子的存在。樣品的橫向弛豫時間（T2）的變化可通過微型核磁共振儀檢測出來，該變化可通過目標DNA存在的情況下用磁性納米顆粒修飾微球的表面，用磁性納米顆粒標記目標細胞的表面、目標分析物存在的情況下磁性納米顆粒之間的團聚等方式獲得。研究結果表明該技術可成功實現蛋白（1 pmol/L LOD）、核酸（0.2~10 pmol/L LOD）、腫瘤細胞（2 cell）和細菌（1 CFU/uLLOD）的檢測。

磁性納米顆粒同樣可以直接用作報告探針，通過其產生的磁信號指示目標分子的存在。樣品的橫向弛豫時間（T2）的變化可通過微型核磁共振儀檢測出來，該變化可通過目標DNA存在的情況下用磁性納米顆粒修飾微球的表面，用磁性納米顆粒標記目標細胞的表面、目標分析物存在的情況下磁性納米顆粒之間的團聚等方式獲得。研究結果表明該技術可成功實現蛋白（1 pmol/L LOD）、核酸（0.2~10 pmol/L LOD）83]）、腫瘤細胞（2 cell）和細菌（1 CFU/uLLOD）的檢測。

2.4 基于電化學信號的納米體外檢測應用

電化學生物檢測是過去50年來逐漸發展起來的另一類生物傳感技術。該技術的核心是傳感器，它可以將與化學分析物相互作用后使系統電學性能（如電流、電位或者阻抗）發生變化的信號通過電子設備檢測出來。這種技術主要有生物催化傳感和生物親和性傳感2種檢測途徑。在生物催化傳感途徑中，酶被固定在電極的表面，其底物為目標分析物。當酶與分析物相結合后，將產生電活性的化學物質，或者直接將電子傳遞到電極。一般采用高催化活性的酶可獲得高檢測靈敏度（fmol/L）（圖6（a）），而底物的特異性結合將使得復雜的混合物檢測不需要樣品的預處理。但是，這種方法的主要缺點是酶只能用于有限數量的底物。而在生物親和性傳感檢測途徑中，電極上一般預先包覆抗體或者DNA探針，用于識別目標蛋白、小分子抗原或者用來和互補的DNA雜化。當目標物和這些探針結合后將調節表面的電學性能，從而改變檢測的電信號。由于抗體可用于大量抗原，而DNA探針則可被設計成各種序列，因此這種技術可以推廣至多種目標檢測物。但是，由于沒有信號放大的步驟，該檢測方法的檢測靈敏度仍然受到一定的限制。

為了提高生物親和性電化學傳感的檢測靈敏度，多種基于納米材料的檢測方法被開發出來。如采用不同的抗體受體修飾納米線場效應管后用于檢測單個病毒顆粒（圖6（b））。電極上也可以包覆上金納米顆粒或者碳納米管，通過改變其阻抗從而獲得更高的檢測靈敏度。目前采用該技術已成功實現了DNA（pmol/L LOD）、蛋白質（1 nmol/L LOD[91]）、病毒（單個）及細菌（10~100個）的高靈敏檢測。而采用納米顆粒-標記表面-結合分析物的類三明治結構可以通過提高阻抗強度的調節來獲得更高的檢測靈敏度，從而成功實現核酸（fmol/L LOD）和蛋白質（fmol/L LOD）的檢測。DNA的多指標檢測則可通過使用多種具有不同伏安特征的納米晶標記實現。當然，電化學生物檢測技術也同樣存在一些缺點，包括非特異性吸附、需要控制檢測溶液的離子強度以及相對短的使用壽命等。

2.5 基于顏色變化的納米體外檢測應用

比色檢測和其他檢測方法相比的優勢在于不需要任何的設備來讀取信號，因此特別適合快速檢測的應用。目前報道最多的是利用金納米顆粒聚集后顏色發生變化來進行檢測。由于SPR效應，金納米顆粒在可見光范圍顯示出很強的吸收。常用于體外檢測的金納米顆粒粒徑一般約為13 nm，其吸收峰約在520 nm，導至其溶液顯示出亮紅色。但是，當金納米顆粒之間的距離小于它們的粒徑時，它們的SPR場將發生耦合共振，使得溶液吸收峰向長波方向紅移，導至溶液顏色發生從紅到藍的逐漸變化，且容易通過肉眼識別。目前已經有很多利用金納米顆粒連接分析物導至其聚集，從而產生顏色變化，最終實現目標物的比色檢測。

該比色檢測技術可采用1種或者2種探針的策略實現目標物的檢測（圖7）。單探針策略中，金納米顆粒表面用1種可和目標DNA互補的DNA探針修飾。當目標DNA存在時，由于金納米顆粒表面的探針可以和目標DNA雜化，使得其可保持單分散性而不會聚集。而當目標DNA不存在時，由于溶液中鹽的濃度較高將導至金納米顆粒聚集，發生從紅到藍的顏色變化。雙探針策略中，2種金納米顆粒分別修飾不同的探針。當目標DNA存在時，2種金納米顆粒通過目標DNA發生交聯最終發生聚集。而目標DNA不存在時，2種金納米顆粒都可以以單分散的形式穩定存在于溶液中。盡管基于金納米顆粒聚集反應的比色檢測簡單、快捷且不需要任何貴重的檢測設備，但是檢測過程沒有信號放大的步驟，導至其檢測靈敏度有限（nmol/L級別）。金納米顆粒與DNA 酶的偶聯可以提供信號的線性放大，從而提高核酸檢測的靈敏度。金納米顆粒在從聚集態變化到單分散狀態的過程中其吸收峰會發生藍移，使溶液的顏色由暗紫色變為紅色。因此，基于多組分核酸酶修飾金納米顆粒的檢測可提供簡單、快捷的比色檢測，適用于核酸的快速檢測。但是對于檢測一些濃度較低的目標物時仍然需要增加額外的信號放大步驟。

2.6 基于熱信號的納米體外檢測應用

可以產生熱的納米顆粒一般常見于腫瘤組織的熱療應用中。最近已有研究開始利用金屬納米顆粒的熱性能用于疾病的檢測上。目前已經發現有很多類型的納米材料可以在光或者電的激發下產生熱，例如金納米棒和碳納米管等可在近紅外激光的照射下產生熱。被激發后，納米材料中的電子和局部的水分子發生相互作用，當它們躍遷到基態時則發生振動和散熱。最近，研究人員利用熱成像技術探索了金納米顆粒在側向層析檢測中的應用（圖8）。在該系統中，抗體標記的金納米顆粒作為對比劑產生的熱信號可被熱檢測儀放大并檢測出來。該檢測儀可將激光波長和金納米顆粒的等離子共振峰進行匹配，并用近紅外探測器來檢測溫度的上升，最終實現金納米顆粒信號的定量檢測。目前，使用熱對比信號檢測可將側向層析檢測靈敏度提高32倍。通過使用熱對比信號放大檢測儀，在側向層析條上檢測甲型流感、瘧疾和艱難梭菌與傳統可視化層析檢測相比，其靈敏度可提高8倍。盡管該技術還處于發展初期，研究結果表明該技術不僅可保持側向免疫層析檢測技術的簡便性，還可提供更高的檢測靈敏度，有望應用于更為復雜的分子檢測。此外，目前眾多光熱性能優異的納米材料同樣為基于熱信號體外檢測技術的發展提供了更多選擇。

3 結論

納米材料近年來已被成功用于提高體外檢測的靈敏度，提供不同的讀出信號，并且可同時檢測多個目標物并簡化檢測過程。基于納米材料的體外檢測可設計為顏色、熱、熒光、磁、電化學及拉曼信號顯示，有利于在檢測系統中提供多種功能選擇。顯然，納米體外診斷技術在諸多應用領域已呈現極大潛力，特別是在快速檢測方面。但是，要實現納米體外診斷技術在體外診斷領域的臨床轉化，仍然還有不少壁壘需要克服。

1）納米材料在體外檢測應用中涉及納米材料的設計、合成、表面修飾和生物偶聯等多個步驟，這些步驟對于確定納米探針的整體性能非常重要。由于納米材料表面化學的復雜性，因此發展更好的制備（特別是宏量制備）及修飾技術以獲得性能重復性優異、表面涂層堅固以及功能化和生物偶聯過程靈活的納米探針至關重要。

2）目前的納米體外診斷技術大多包括多個操作步驟，如樣本的提取、純化和檢測，而這些過程均需要專業熟練的人員完成。因此，通過開發一體化的便攜式設備實現自動檢測，減少人力勞動，也是未來的發展方向。

3）目前很多納米檢測試劑盒還處于臨床前的階段，仍然需要從實際臨床的角度通過大量臨床樣本來驗證全面評價這些技術的性能。在納米體外診斷技術的研發早期對其進行臨床的評估有助于加速其臨床轉化，這樣病人樣本的多樣性特點可以在技術設計過程就被考慮在內。

顯然，從事納米體外診斷技術的研究者應該聚焦于解決以上這些問題，這將有助于這些基于納米材料的體外診斷技術最終實現臨床轉化，服務于社會，造福于普通百姓。