組織病理實驗（二）

9.  展片、貼片

打開水浴鍋，使水溫維持在40~45℃，另準備30%乙醇溶液。

（1）切片時，將一碗30%乙醇溶液放于切片機旁的桌面上。

（2）用小鑷子夾取預先用刀片割開的蠟帶，放在乙醇溶液的水面上，使切片展開。

（3）小鑷子輕輕地將連在一起的切片分開，用一個載玻片將切片完整，已展開的切片撈至溫水中，使之充分展開。

（4）另取潔凈的載玻片，撈起展開的切片，使其位于切片1/3處，另一端（磨邊，粗糙的一端）磨面上標記或貼上標簽，放于切片架上。

10.  脫蠟復水

（1）將水浴鍋溫度調至60℃，待水溫控制在60℃時。

（2）將切片連同切片架放入一干燥的染色缸內，放入水浴鍋中，蓋上蓋子（可密封），30 min 至蠟熔化。

（3）之后，石蠟切片經二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟各5 min，然后放入100%、95%、90%、80%、70%各級酒精溶液中各3~5 min，再放入蒸餾水中3 min。

11.  染色

（1）切片放入蘇木精中染色約10~30 min。

（2）染色時間應根據染色劑的成熟程度及室溫高低，適當縮短或延長。

（3）室溫高時促進染色，染色時間可短些，否則可適當延長時間，冬季室溫低時可放入恒溫箱中染色。

12.  水洗

（1）用自來水流水沖洗約15 min。

（2）使切片顏色變藍（或放入堿性水中也可）。

（3）但要注意流水不能過大，以防切片脫落。

13.  分化

（1）將切片放入1%鹽酸乙醇液中褪色。

（2）約2秒至數十秒鐘，見切片變紅，顏色較淺即可。

14.  漂洗

切片再放入自來水流水中使其恢復藍色。

15.  脫水Ⅰ

切片入50%乙醇→70%乙醇→80%乙醇中各3~5 min。

16.  復染

（1）用0.5%伊紅乙醇液對比染色1~3 min。

（2）伊紅主要染細胞質，著色濃淡應與蘇木精染細胞核的濃淡相配合，如果細胞核染色較濃，細胞質也應濃染，以獲得鮮明的對比。

（3）反之，如果細胞核染色較淺，細胞質也應淡染。可在伊紅乙醇液中滴加數滴冰醋酸助染，促使細胞質容易著色，并且經乙醇脫水時不易褪色。

17.  脫水Ⅱ

（1）將切片放入95%乙醇中洗去多余的紅色。

（2）然后放入無水乙醇中3~5 min。

（3）最后用吸水紙吸干多余的乙醇。

18.  透明

（1）切片放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各3~5 min。

（2）二甲苯應盡量保持無水，應經常更換，或用紗布包無水硫酸銅放入染色缸內吸收水分。

（3）切片如在二甲苯中出現白霧現象，說明脫水未盡，應退回乙醇中重新脫水，否則切片難以鏡檢。

19.  封藏：中性樹膠封存

因切片經二甲苯透明，使用中性樹膠作為封藏劑，樹膠可用二甲苯稀釋至合適的稠度。

20.  封藏的方法：

（1）封片前應根據材料的大小，選用不同規格的蓋玻片。

（2）材料透明后，在桌上放一張潔凈的吸水紙，將含材料的載玻片從二甲苯中取出放在紙上（切片的一面向上）。

（3）迅速地在切片的中央滴一滴樹膠（千萬不能待二甲苯干燥后再進行），用右手持小鑷子輕輕地夾住蓋玻片的右側，稍為傾斜使其左側與封藏劑接角，然后再緩慢地將蓋玻片放下，這樣就可以減少或避免產生氣泡。

（4）如膠液不足，可以用玻棒再滴一滴樹膠從蓋玻片邊緣補足。

（5）如膠液過多，可在干燥以后用刀刮去，并用紗布蘸二甲苯拭去殘留的樹膠。

（6）染色結果：細胞核被蘇木素染成藍色，細胞質被伊紅染色呈粉紅色。

三、免疫組化染色

1.  石蠟切片，步驟同前。切片經貼片后，60℃烤片30 min使蠟熔化，經二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10 min，脫蠟。然后，將切片放入100%、95%、90%、80%、70%乙醇中3~5 min，再放入蒸餾水中3 min，水化。

2.  脫蠟和水化后，用PBS（pH7.4，具體看所用抗體及染色試劑說明）沖洗3次，每次3分鐘。洗瓶沖洗。

3.  根據抗體的要求，對組織抗原進行相應的修復。可選步驟，具體見抗體說明書。

4.  每張切片加1滴或50 μl 3%過氧化氫，室溫下孵育10分鐘，以阻斷內源性過氧化物酶的活性。PBS沖洗3次，每次3分鐘。此步驟是對內源性過氧化物酶含量高的組織而言。

5.  除去PBS液，每張切片加1滴或50 μl 的第一抗體，室溫下孵育60分鐘或4℃過夜，具體參見每種抗體的說明書。PBS沖洗3次，每次3分鐘。

6.  除去PBS液，每張切片加1滴或50 μl 即用型MaxVisionTM試劑或SP試劑，室溫下孵育10~15分鐘。PBS沖洗3次，每次3分鐘。

7.  除去PBS液，每張切片加2滴或100 μl新鮮配制的DAB或AEC溶液，顯微鏡下觀察3~5分鐘（DAB）或37℃環境下10~30分鐘（AEC）。

8.  自來水沖洗，蘇木素復染10分鐘，PBS或自來水沖洗返藍。如果用DAB顯色，則切片經過梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，步驟同H-E染色，中性樹膠封固；如果用AEC顯色，則切片不能經酒精脫水，而直接用水性封片劑封片。

收起 

注意事項

一、取材注意事項

1.  取材動作要迅速，不宜作太久的拖延以免組織細胞的成分、結構等發生變化。

2.  切片材料應根據需要觀察的部位進行選擇，盡可能不要損傷所需要的部分。

二、固定注意事項

1.  一般固定液，都以新配為好，配好后應貯存在陰涼處，不宜放在日光下，以免引起化學變化，失去固定作用。

2.  有些混合固定液的成份之間會發生氧化還原作用，一定要在使用前才混合，如果混合太早，固定時就沒有作用了。

3.  固定材料時，固定液必須充足，一般為材料塊的20~30倍，有些水分多的材料，中間應更換1~2次新液。

4.  材料固定完畢后，保存于嚴密緊塞或加蓋的容器里，同時在容器外上標簽，并隨同材料在溶液中投入相應的標簽，以免相互混淆。標簽上注明固定液、材料來源、日期等。標簽上的文字，應用黑色鉛筆或繪圖黑墨水書寫。

三、脫水注意事項

1.  脫水必須在有蓋的玻璃品中進行，防止吸收空氣中的水分。

2.  在更換高一級的脫水劑時，最好不要移動材料以免損壞，可用吸管吸出器皿中的脫水劑，再用吸水吸盡器皿內剩余液，然后于皿中加入高一級脫水劑。

3.  在低濃度酒精中，每級停留不宜太長，否則易使組織變軟，助長材料的解體。

4.  在高濃度或純酒精中，每級停留的時間也不宜太長，否則會使組織變脆，影響切片。

5.  如需過夜，應停留在70%酒精中。

6.  脫水必須徹底，否則不易透明，甚至使透明劑內出現白色混濁現象。

四、透明注意事項

1.  使用透明劑時，要隨時蓋緊蓋子，以免空氣中的水分進入。

2.  更換每級透明劑，動作要迅速，一方面為了不使材料塊干涸，另一方面能避免吸收濕氣。

3.  在透明過程中，如果材料周圍出現白色霧狀，說明材料中的水未被脫凈，應退回純酒精中重新脫水，然后再透明。

五、透蠟注意事項

1.  盡量保持在較低溫度中進行，以石蠟不凝固為度。

2.  透蠟溫度要恒定，不可忽高忽低。

3.  操作要迅速，力求在最短的時間內完成石蠟透入過程，以免引起組織變硬、變脆、收縮等。