細胞、細胞器及組分的分離與觀察1

葉綠體的分離與熒光觀察
一、實驗目的
了解葉綠體分離的一般原理和方法,并熟悉應用熒光顯微鏡方法觀察葉綠體熒光現象。
二、實驗原理
葉綠體是植物細胞中較大的一種細胞器,能發生特有的能量轉換。利用低速離心機可以分離葉綠體,其分離在等滲溶液（0.35mol/L氯化鈉或0.4mol/L蔗糖溶液）中進行,目的是為了防止滲透壓的改變引起葉綠體的損傷。將勻漿液在1000r/min離心,去除其中的組織殘渣和一些未被破碎的完整細胞,然后,3000r/ min離心,可獲得沉淀的葉綠體（混有部分細胞核）。在室溫下進行分離要迅速。
三、實驗用品
材料：菠菜葉片
試劑：蒸餾水,0.35mol/L氯化鈉溶液,0.01%吖啶橙
儀器：普通離心機,研缽,天平,熒光顯微鏡,載玻片,蓋玻片,鑷子,恒溫箱,培養皿,濾紙,試管,試管架,移液管, 滴管,燒杯,離心管
四、實驗步驟
1.選取新鮮的菠菜嫩葉,洗擦干后去除葉梗及粗脈,稱3g于0.35mol/L氯化鈉溶液15ml中置組織搗碎機或研缽中。
2.利用組織搗碎機低速（5000r/min）勻漿,3-5min,或研磨成勻漿。
3.用6層紗布過濾,濾液盛于燒杯中。
4.取濾液4mL在1000r/min下離心2min,棄去沉淀。
5. 將上清液在3000r/min下離心5min,棄去上清液,沉淀即為葉綠體（混有部分細胞核）。
6.沉淀用0.35mol/L氯化鈉溶液懸浮。
7.取葉綠體懸液1滴置于載玻片上,加蓋玻片后用普通光學顯微鏡觀察。使用熒光顯微鏡觀察時,將葉綠體懸液滴在無熒光的載玻片上,再滴加1滴0.01%吖啶橙熒光染料,蓋上無熒光的蓋玻片后即可觀察。
8.觀察葉綠體的形態結構、葉綠體發射熒光的現象。

線粒體和細胞核的制備與觀察
一、實驗目的
1.對分離得到的細胞核及線粒體進行活性鑒定。
2.掌握用差速離心技術分離制備動物細胞核及線粒體的方法
二、實驗原理
利用細胞核與線粒體在一定介質中的沉降速度的差異,可采取分級差速離心的方法,將細胞核與線粒體逐級分離出來（差速離心技術）。
線粒體是真核細胞特有的進行能量轉換的重要細胞器。將動植物組織制成勻漿,在適當的懸浮介質中差速離心法可以分離細胞線粒體。在一定的離心場中（選用離心機的一定轉速）,球心顆粒的沉降速度取決于它的密度、半徑和懸浮介質的黏度。在一均勻的懸浮介質中離心一定時間,組織勻漿中的各種細胞器及其它內含物由于沉降速度不同將停留在高低不同的位置。依次增加離心力和離心時間,就能夠使這些顆粒按其大小、輕重分批沉降在離心管底部,從而分批收集。細胞器沉降先后順序先后是細胞核、線粒體、溶酶體和其他微體、核糖體和大分子。
懸浮介質通常采用緩沖的蔗糖溶液,它較接近細胞質的分散相,在一定程度上能保持細胞器的結構和酶的活性；pH7.2的條件下,亞細胞組分不容易聚集成團,有利于分離。整個操作過程樣品要保持在0℃-4℃,避免酶失活。