細菌克隆的溶解實驗

大腸桿菌噬菌體

IPTG溶源菌抽提緩沖液氯化鈉溶菌酶LB瓊脂平板

氣體恒溫箱液氮Millipore 濾紙水浴搖床牙簽或接種環噬菌體λgt11λgt18-23λZAP 和λZipLox 重組子大腸桿菌 Y1090 hsdR 菌株及 Y1089 菌株

材料

緩沖液和溶液

貯存液，緩沖液和試劑的組分請見附錄 1。
將貯存液稀釋到適當的濃度。

IPTG(1mol/L)
誘導每升溶源菌需要大約 40ul lmol/L 的 IPTG。

溶源菌抽提緩沖液
50mml/L Tris-Cl(pH7.5)
1 mmol/LEDTA(pH8.0)
5 mmol/L 二硫蘇糖醇
50ug/ml 苯甲基磺酰氟化物（PMSF)
進行步驟 13 和 18 之前在溶源菌抽提緩沖液中加入 PMSF。每誘導 20 溶源菌需要大約 100 ml 溶源菌抽提緩沖液。

氯化鈉（5mol/L)
于 4℃貯存 NaCl 溶液。

酶和緩沖液

溶菌酶（10 mg/ml)
在10mmol/L Tris-Cl(pH8.0) 中溶解固體溶菌酶（分于生物學級）使其濃度為 10 mg/ml。需在進行步驟 15 時新鮮配制該溶液。

培養基

含 50ug/ml 氨芐青霉素的 LB 瓊脂平板
LB 培養基
含 50ug/ml 氨芐青霉素的 LB 培養基
含 10 mmol/LMgCl₂ 的 LB 培養基
含 10 mmd/LMgCl₂,0.2%(m/V) 麥芽糖和 5Oug/ml 氨芐青霉素的 LB 培養基

專用設備

氣體恒溫箱調整至 32℃和 42℃
液氮

Millipore 濾紙
138 mm 圓形濾紙（Millipore 型 VS,0.0025um 孔徑濾紙）用于透析溶解產物，每張濾紙可以透析 20 溶解產物。

水浴搖床調整至 44℃
如果無水浴搖床，在 44℃ 水浴即可。

牙簽或接種環

附加試劑
本方案步驟 1 所需試劑見第 2 章方案 3。

載體和菌株

噬菌體λ;gt11,λgt18-23,λZAP 和λZipLox 重組子
本方案優化了噬菌體λgt11 重組子表達重組融合蛋白（可以采用方案 1 或方案 6 中所列的方法或雜交和 DNA 序列分析來鑒別）的方法。在其他多種λ噬菌體表達載體上構建的重組子可用于本節所述的溶源菌的構建。

大腸桿菌 Y1090 hsdR 菌株及 Y1089 菌株
這些菌株可以從 ATCC(www.atcc.org) 獲得并在含 50ug/ml 氨芐青霉素的 LB 瓊脂平板上保存。Y1090 和 Y1089 菌株帶有 lon 基因的突變，lon 基因編碼一種 ATP 依賴的蛋白酶。這些菌株表達的融合蛋白質常常比那些沒有發生突變的菌株更穩定。Y1089 帶有 hflA 突變. 該突變可顯著增加λ噬菌體發生溶源菌現象的頻率。另外，Y1089 缺乏一種 tRNA 基因抑制子，這樣，在λgtll 的 S 基因（溶解基因）上的琥珀突變在此菌株中不能夠被抑制，結果大量λ噬菌體編碼的基因產物包括 LacZ 融合蛋白質）在被誘導細胞內高水平聚集。如需了解大腸桿菌 Y1090 和 Y1089 菌株的其他資料，請見信息欄中質粒和λ噬菌體表達載體的相關內容。

方法

1. 按第 2 章方案 2~3 介紹的方法制備各特定重組噬菌體的平板原種，根據在大腸桿菌 Y1090 hsdR 株進行的測定，原種的滴度應大于 10¹⁰pfu/ml。

2. 大腸桿菌 Y1090 hsdR 株在 2 mlLB 培養基中生長至飽和，培養基中補充 0.2% 麥芽糖、50ug/ml 氨芐青霉素和 10 mmol/LMgCl₂。

3. 用 2 ml 含 10 mmol/LMgCl₂ 的 LB 培養基稀釋 50ul 上述飽和菌液，分到另外 4 個培養管中，每管 100ul。

4. 在 3 支管內分別加入 1X10⁷、5X10⁷ 及 2X10⁸ 噬斑形成單位（pfu) 的噬菌體原種。第四管內不加噬菌體。于 37℃ 溫育 20 min, 使病毒吸附。

5. 從 4 管培養物中各吸取 100 稀釋在 10 mlLB 培養基中，立即從各稀釋菌液中吸取少量（100ul) 鋪到含 50ug/ml 氨芐青霉素的 LB 平板上，于 32℃ 溫育平板 18~24 h。
接種未感染大腸桿菌 Y1090hsdR 株菌液的平板上不應出現菌落，而感染的培養物則會產生 50~500 個菌落，這取決于最初飽和菌液的密度和噬菌體的確切感染復數。

6. 使用無菌牙簽，挑取單個菌落放到兩個含 50ug/ml 氨芐青霉素的 LB 平板上，兩塊平板分別置于 32℃ 和 42℃ 溫育 12~16 h。凡所出現的菌落在 32℃生長而在 42℃ 不生長的克隆，即為重組λ噬菌體的溶源性克隆，通常在所檢測菌落中有 10%~70% 溶源菌。

7. 以單個噬菌體溶源菌接種于 2 ml 含 50ug/ml 氨芐青霉素 LB 培養基中，于 32℃ 劇烈振蕩培養 12~16 h(300r/min)。

8. 從每個培養管中吸取 50ul 加到 4 ml 預溫（32℃) 的 LB 培養基 (含 50ug/ml 氨芐青霉素）中，32℃ 繼續劇烈振蕩培養。

9. 細菌培養物生長至 OD₆₀₀=0.45(約培養 3 h)。
重要：誘導溶源菌之前，細菌堉養物 OD₆₀₀ 不應超過 0.5(約 2X10⁸ 個細菌/ml)。

10. 把培養物轉移到溫度已達到 44℃ 的水浴中溫育 15 min。
溫度迅速從 32℃ 升至 44℃ 誘導效果最佳。據此將培養物轉移到設定在 44℃ 的恒溫水浴要優于干熱培養箱。44℃ 培養時應不斷劇烈振蕩培養物。
加熱到此溫度只是部分失活 cIts857 阻遏物，當培養物冷卻到 37℃ 時又可恢復活性（Mandal and Lieb1976)。但是，阻遏物的濃度太低，無法阻止 Cro 蛋白的合成，而 Cro 蛋白又可與 OR3 結合進而阻止阻遏物的合成。加熱后，培養物進入了一個不可逆的噬菌體裂解性生長循環。

11. 每管培養物中加入 IPTG 至終濃度為 10 mmol/L。于 37℃ 劇烈振蕩培養 1 h。

12. 將 1.5 ml 經過誘導的溶源培養物轉入 2 個微量離心管內，立即于以最大轉速離心 30s。

13. 吸出培養液，加入 100ul 溶源菌抽提緩沖液，迅速通過振蕩重懸細菌沉淀。

14. 蓋緊管蓋，置于液氮中。

15.2 min 后，將離心管從液氮中取出。握在手中至裂解液剛剛融化，各管內迅速加入20ul 10 mg/ml 的溶菌液，在冰浴中放置 15 min。

16. 各管中加入 250ul 5 ml/LNaCl。用手指輕彈管壁混勻內容物，在轉輪上于溫育 30 min。

17. 于 4℃ 以最大轉速離心 30 min。

18. 離心過程中，4℃ 下將溶源菌抽提緩沖液傾注于一個平皿（150 mm)，再將 Millipore濾膜（VS 型 0.025um 孔徑）漂浮在液面上。
最好在冷室僻靜角落中進行操作，注意不要讓溶源菌抽提緩沖液濺到濾膜的上表面。

19. 將上清液從離心管中轉移至濾膜上表面，一張濾膜可加入多達 20 個不同樣品。

20. 在 4℃ 放置 l~2 h 后，再將透析后的樣品吸到另一個微量離心管中，用前在-70℃ 保存。

21. 用甲基化保護實驗、DNA 酶 I 足跡法或凝膠電泳 DNA 結合實驗（凝膠電泳遷移率滯后實驗）等方法分析裂解液中的 DNA 結合蛋白。
純化融合蛋白可通過購買親和層析試劑盒來實現（如 PntoSotb lacZ 免疫親和吸附劑，Promega) 或按第 15 章所述方法進行。
裂解原液或純化的融合蛋白可用來檢測外源蛋白酶活性或通過免疫印跡來檢測其免疫化學交叉反應性。
純化的融合蛋白可用來產生抗外源蛋白質的抗體，此抗體可用于鑒定一段 cDNA 編碼的蛋白質（可通過組織鑒定或部分純化分析)，或抑制某種酶的活性或通過親和層析純化天然外源蛋白質。

裂解原液或純化的融合蛋白可用來檢測外源蛋白酶活性或通過免疫印跡來檢測其免疫化學交叉反應性。

純化的融合蛋白可用來產生抗外源蛋白質的抗體，此抗體可用于鑒定一段 cDNA 編碼的蛋白質（可通過組織鑒定或部分純化分析），或抑制某種酶的活性或通過親和層析純化天然外源蛋白質。

純化融合蛋白可通過購買親和層析試劑盒來實現（如 PntoSotb lacZ 免疫親和吸附劑，Promega) 。

本實驗來源于分子克隆實驗指南（第三版）下冊，作者：〔美〕J. 薩姆布魯克 D.W. 拉塞爾。