細菌質粒DNA的小量制備

實驗方法原理

由于大腸桿菌染色體 DNA 比通常用作載體的質粒 DNA 分子大得多，因此在提取過程中，染色體 DNA 易斷裂成線型 DNA 分子，而大多數質粒 DNA 則是共價閉環型，根據這一差異便可以設計出各種分離、提純質粒 DNA 的方法。堿裂解法就是基于線型的大分子染色體 DNA 與小分子環型質粒 DNA 的變性復性之差異而達到分離目的。在 pH 12.0～12.6 的堿性環境中，線型染色體 DNA 和環型質粒 DNA 氫鍵均發生斷裂，雙鏈解開而變性，但質粒 DNA 由于其閉合環型結構，氫鍵只發生部分斷裂，而且其二條互補鏈不會完全分離，當將 pH 調至中性并在高鹽濃度存在的條件下，已分開的染色體 DNA 互補鏈不能復性而交聯形成不溶性網狀結構，通過離心大部分染色體 DNA、不穩定的大分子 RNA 和蛋白質-SDS 復合物等一起沉淀下來而被除去。而部分變性的閉合環型質粒 DNA 在中性條件下很快復性，恢復到原來的構型，呈可溶性狀態保存在溶液中，離心后的上清中便含有所需要的質粒 DNA，再通過用酚、氯仿抽提，乙醇沉淀等步驟而獲得純的質粒 DNA。

實驗材料 大腸桿菌

試劑、試劑盒 含氨芐青霉素（Amp）的 LB 液體培養基固體培養基溶液ⅠⅡⅢ和ⅣTE 緩沖液無DNase 的 RNase冷乙醇TAE 緩沖液瓊脂糖凝膠凝膠加樣緩沖液溴化乙錠氨芐靑霉素水溶液

儀器、耗材 穩壓電泳儀水平式微型電泳槽透射式紫外分析儀旋渦混合器微量加樣器

實驗步驟

1. 挑取大腸桿菌 TGI/pUC18 的一個單菌落于盛 5 ml LB 培養基的試管中（含 100 ug/ml 的氨芐青霉素），37 ℃ 振蕩培養過夜（約 16～24 h）。

2. 吸取 1.5 ml 的過夜培養物于一小塑料離心管（又稱 Eppendorf 管）中，離心（12000 r/min，30 s）后，棄去上清，留下細胞沉淀。

離心可在 4℃ 或室溫（25℃～28℃）下進行，離心時間不可太長，以免影響下一步菌體的分散懸浮。

3. 加入 100 ul 冰預冷的溶液 Ⅰ，在旋渦混合器上強烈振蕩混勻。

要確保細胞被完全懸浮，使細胞最大數量地接觸下一步的溶液 Ⅱ，達到完全裂解，以提高質粒的質量。

4. 加入 200 ul 溶液 Ⅱ，蓋嚴管蓋，反復顛倒小離心管 5～6 次或用手指彈動小管數次，以混合內容物。置冰溶中 3～5 min（根據不同菌株，可適當縮短）。

5. 加入 150 ul 溶液 Ⅲ，在旋渦混合器上快速短時（約 2 s）振蕩混勻，或將管蓋朝下溫和振蕩10 s，置冰溶 3～5 min。

確保完全混勻，又不致使染色體 DNA 斷裂成小片段。

6. 離心（12000 r/min）5 min，以沉淀細胞碎片和染色體 DNA。取上清轉移至另一沽凈的小離心管中。

7. 加入等體積的溶液 Ⅳ 振蕩混勻，室溫下離心 2 min，小心吸取上層水相至另一潔凈小離心管中。

8. 加入 2 倍體積的冷無水乙醇，置室溫下 2 min 以沉淀核酸。

9. 室溫下離心 5 min，棄上清。加入 1 ml 70％ 乙醇振蕩漂洗沉淀。

10. 離心后，棄上清，可見 DNA 沉淀附在離心管管壁上，用記號筆標記其位置，并用消毒的濾紙小條小心吸凈管壁上殘留的乙醇，將管倒置放在濾紙上，室溫下蒸發痕量乙醇 0～15 min，或真空抽干乙醇 2 min，也可在 65 ℃ 烘箱中干燥 2 min。

11. 加入 50 ul TE 緩沖液（含 RNase，20 ug/ml）充分混勻，取 5 ul 進行瓊脂糖凝膠電泳，剩下的貯存於－20 ℃ 冰箱內，為下一個實驗用。

用加入的 50 ul TE 緩沖液多次，反復地洗滌 DNA 沉淀標記部位，以充分溶解附在上的質粒 DNA。

12. 瓊脂糖凝膠電泳觀察質粒 DNA

12.1 將微型電泳槽的膠板二端擋板插上，在其一端放好梳子，在梳子的底部與電泳槽底板之間保持約 0.5 mm 的距離。

12.2 用電泳緩沖液配制 0.7％ 的瓊脂糖膠，加熱使其完全溶化，加入一小滴溴化乙錠溶液（1 mg/ml），使膠呈微紅色，搖勻（但不要產生氣泡冷至 65 ℃ 左右，倒膠（凝膠厚度一般為 0.3～0.5 cm）。倒膠之前先用瓊脂糖封好電泳膠板二端擋板與其底板的連接處，以免漏膠。

根據實驗需要，溴化乙錠溶液也可不直接加入膠中，而是在電泳完畢后，將凝膠放在含 0.5 mg/ml 的 EB 中染色 15～30 min，然后轉入蒸餾水中脫色 15～30 min。

12.3 待膠完全凝固后，小心取出二端擋板和梳子，將載有凝膠的電泳膠板（或直接將凝膠）放入電泳槽的平臺上，加電泳緩沖液，使其剛好浸沒膠面（液面約離出膠面 1 mm）。

12.4 取上述獲得的質粒 DNA 3～5 ul 加 1～2 ul 加樣緩沖液（內含溴釀藍指示劑），混勻后上樣。

12.5 接通電源，記住：上樣槽一端位于負極，電壓降選擇為 1～5V/cm（長度以兩個電極之間的距離計算）。

12.6 根據指示劑遷移的位置，判斷是否中止電泳。切斷電源后，再取出凝膠，置紫外透射儀上觀察結果或拍照。

EB 特異性地插入質粒 DNA 分子后，因為同一種質粒的相對分子質最大小一致，因此在凝膠中形成一條整齊的熒光帶而有別子染色體熒光帶。

注意事項

不要強烈振蕩，以免染色體 DNA 斷裂成小的片段而不易與質粒 DNA 分開。