膠體金標記實驗操作步驟

1、蛋白質的處理：膠體金標記蛋白的制備

膠體金對蛋白的吸附主要取決于pH值，在接近蛋白質的等電點或偏堿的條件下，二者容易形成牢固的結合物。如果膠體金的pH值低于蛋白質的等電點時，則會聚集而失去結合能力。除此以外膠體金顆粒的大小、離子強度、蛋白質的分子量等都影響膠體金與蛋白質的結合。

（1）待標記蛋白溶液的制備 將待標記蛋白預先對0.005Mol/L pH7.0 NaCl溶液中4℃透析過夜，以除去多余的鹽離子，然后 100 000g4℃離心1h，去除聚合物。

（2）待標膠體金溶液的準備 以0.1Mol/L K2CO3或0.1Mol/L HCl調膠體金液的pH值。標記IgG時，調至9.0；標記 McAb時，調至8.2；標記親和層析抗體時，調至7.6；標記SPA時，調至5.9～6.2；標記ConA時，調至8.0；標記親和素時，調至 9～10.

由于膠體金溶液可能損壞pH計的電板，因此，在調節pH時，采用精密pH試紙測定為宜。

由于鹽類成分能影響金溶膠對蛋白質的吸附，并可使溶膠聚沉，故致敏前應先對低離子強度的水透析。必須注意，蛋白質溶液應絕對澄清無細小微粒，否則應先用微孔濾膜或超速離心除去。

一般情況下應避免磷酸根離子和硼酸根離子的存在，因為它們都可吸附于顆粒表面而減弱膠體金對蛋白質的吸附。

2、蛋白質最適用量的選擇：膠體金與標記蛋白用量之比的確定

（1）根據待標記蛋白的要求，將膠體金調好pH之后，分裝10管，每管1ml.

（2）將標記蛋白（以IgG為例）以0.005Mol/L pH9.0硼酸鹽緩沖液做系列稀釋為5μg/ml～50μg/ml，分別取1ml，加入上列金膠溶液中，混勻。對照管只加1ml稀釋液。

（3）5min后，在上述各管中加入0.1ml 10％NaCl溶液，混勻后靜置2h，觀察結果。

（4）結果觀察，對照管（未加蛋白質）和加入蛋白質的量不足以穩定膠體金的各管，均呈現出由紅變藍的聚沉現象；而加入蛋白量達到或超過最低穩定量的各管仍保持紅色不變。以穩定1ml膠體金溶液紅色不變的最低蛋白質用量，即為該標記蛋白質的最低用量，在實際工作中，可適當增加10％～20％。

將待標記的蛋白質儲存液作系列稀釋后，分別取0.1ml(含蛋白質5～40ug)加到 1ml膠體金溶液中，另設一管不加蛋白質的對照管，５分鐘后加入0.1ml 10％NaCl溶液，混勻后靜置２小時，不穩定的金溶膠將發生聚沉，能使膠體金穩定的最適蛋白量再加10％即為最佳標記蛋白量。

3、標記：膠體金與蛋白質（IgG）的結合

將膠體金和IgG溶液分別以0.1Mol/L K2CO3調pH至9.0，電磁攪拌IgG溶液，加入膠體金溶液，繼續攪拌10min，加入一定量的穩定劑以防止抗體蛋白與膠體金聚合發生沉淀。常用穩定劑是5％胎牛血清（BSA）和1％聚乙二醇（分子量20KD）。加入的量：5％BSA使溶液終濃度為 1％；1％聚乙二醇加至總溶液的1／10.

在接近并略為高于蛋白質等電點的條件下標記是比較合適的，在此情況下蛋白質分子在金顆粒表面的吸附量最大。
下述標記步驟最為常見：

①用0、1mol/L K2CO3或0.1mol/L HCl調節金溶膠至所需pH(標記ＳＰＡ時調到pH6.0)。

②于100ml 金溶膠中加入最佳標記量的蛋白質溶液（體積為２～３ml），攪拌２～３分鐘。

③加入5ml１％PEG20000溶液。

④于10000～100000g離心30～60分鐘（根據粒徑大小選擇不同離心條件），小心吸去上清液（切忌傾倒）。

⑤將沉淀懸浮于一定體積含0.2～0.5mg/ml PEG20000的緩沖液中，離心沉淀后，再用同一緩沖液恢復，濃度以 Ａ1cm /540nm=1.5左右為宜，以 0.5mg/ml疊氮鈉防腐，置4℃保存。

⑥包被后的金溶膠也可濃縮后于Sephadex G-200柱進行凝膠層析分離純化，以含 0.1％ＢＳＡ的緩沖溶液洗脫。通常用IgG包被的金溶膠洗脫液pH為8.2，以Ａ蛋白包被的金溶膠洗脫液為pH7.0.

以上操作中應注意，一切溶液中不應含雜質微粒，可用高速離心或微孔濾膜預處理。

4、膠體金標記蛋白的純化

（1）超速離心法：根據膠體金顆粒的大小，標記蛋白的種類及穩定劑的不同選用不同的離心速度和離心時間。

用BSA做穩定劑的膠體金—羊抗兔IgG結合物可先低速離心（20nm金膠粒用1 200r/min，5nm金膠粒用1 800r /min）20min，棄去凝聚的沉淀。然后將5nm膠體金結合物用6 000g，4℃離心1h；20nm～40nm膠體金結合物，14 000g，4℃ 離心1h.仔細吸出上清，沉淀物用含1％BSA的PB液（含0.02％NaN3），將沉淀重懸為原體積的1／10，4℃保存。如在結合物內加50％甘油可貯存于-18℃保存一年以上。

為了得到顆粒均一的免疫金試劑，可將上述初步純化的結合物再進一步用10％～30％蔗糖或甘油進行密度梯度離心，分帶收集不同梯度的膠體金與蛋白的結合物。

（2）凝膠過濾法：此法只適用于以BSA作穩定劑的膠體金蛋白結合物的純化。將膠體金蛋白結合物裝入透析袋，在硅膠中脫水濃縮至原體積的 1／5～1／10.再經1 500r/min離心20min.取上清加至Sephacryl S-400（丙烯葡聚糖凝膠S-400）層析柱分別純化。層析柱為0.8 cm×20cm，加樣量為床體積的1／10，以0.02Mol/L PBS液洗脫（內含0.1％BSA，0.05％NaN3，pH8.2者用IgG標記物），流速為8ml/h.按紅色深淺分管收集洗脫液。一般先濾出的液體為微黃色，有時略混濁，內含大顆粒聚合物等雜質。繼之為純化的膠體金蛋白結合物，隨濃度的增加而紅色逐漸加深，清亮透明，最后洗脫出略帶黃色的為標記的蛋白組分。將純化的膠體金蛋白結合物過濾除菌、分裝，4℃保存。最終可得到70％～80％的產量。

5、膠體金蛋白結合物的質量鑒定

（1）膠體金顆粒平均直徑的測量：用支持膜的鎳網（銅網也可）蘸取金標蛋白試劑，自然干燥后直接在透射電鏡下觀察。或用醋酸鈾復染后觀察。計算 100個金顆粒的平均直徑。

（2）膠體金溶液的OD520nm值測定：膠體金顆粒在波長510nm～550nm之間出現最大吸收值峰。用 0.02Mol/L pH8.2 PBS液（含1％BSA，0.02％NaN3）將膠體金蛋白試劑作1︰20稀釋，OD520＝0.25左右。一般應用液的OD520應為0.2～0.4。

（3）金標記蛋白的特異性與敏感性測定：采用微孔濾膜免疫金銀染色法（MF－IGSSA）。將可溶性抗原（或抗體）吸附于載體上（濾紙、硝酸纖維膜、微孔濾膜），用膠體金標記的抗體（或抗原）以直接或間接染色法并經銀顯影來檢測相應的抗原或抗體，對金標記蛋白的特異性和敏感性進行鑒定。