膠質瘤干細胞培養

膠質瘤是顱內最常見的腫瘤，病因不清。切除后容易復發，放射治療和化療效果不理想。近年來從成年的腦組織中可以培養出神經干細胞，傳統的觀點認為，膠質瘤中只含有膠質細胞，沒有神經元。近期的研究證明，膠質瘤在體外分化為神經元和星形膠質細胞，證明了膠質瘤中存在干細胞的可能性。這種細胞能夠同時表達神經元和星形膠質細胞的標志物，說明了此種細胞可能存在逆分化的現象，這反映了這種細胞的惡性行為。最近從大鼠C6膠質瘤中也獲得干細胞樣細胞，說明這種干細胞在膠質瘤的發病中可能是普遍存在的。

越來越多的事實支持膠質瘤起源于中樞神經內業已存在的內生性集落細胞，這種細胞可能就是神經干細胞，但尚未找到直接證據。神經干細胞、正常膠質細胞和膠質瘤細胞三者之間是否可以轉化，以及如何轉化的機制，這方面的研究對膠質瘤發病機制的闡明和治療都有明確的理論和實際意義。目前研究可從人類的膠質瘤組織中培養出類似神經干細胞的前體細胞，能夠分化為神經元和星形膠質細胞。

采用培養材料有B27和N2添加劑、DMEM/F12培養基（Gibco/BRL）；堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）、表皮生長因子（epidermal growth factor, EGF）和多聚賴氨酸均為Sigma公司產品；抗波形蛋白單克隆抗體（Dako ,1 :100）、抗神經微絲200（NF200）單克隆抗體（Dako,1:100）；胎牛血清（FBS）；抗巢蛋白（nestin）多克隆抗體（1:100,武漢博士德公司）；抗S100單克隆抗體、抗膠質纖維酸性蛋白（GFAP）單克隆抗體、抗髓鞘基礎蛋白單克隆抗體、抗半乳糖腦苷脂單克隆抗體和抗βⅢ型管蛋白單克隆抗體（1:500, Sigma）；在無菌條件下切取出腫瘤組織，切碎腫瘤組織，將切下的組織放入含有6g/L的葡萄糖的D-hanks液中。用吸管反復抽吸腦組織約20次，使細胞分散成細胞懸液，離心5min（1000 g），棄上清。N2培養基重懸細胞，細胞計數器下計數細胞，將細胞種植在培養板或培養瓶中。細胞密度為6×105~8 ×105/cm2。N2培養基配方如下：DMEM/F12（1:1），加入N2添加劑（1:100）、 4.0 mmol/L谷氨酰胺、50kU/L的青霉素、50kU/L的鏈霉素、5mmol/L Hepes和5mg/L的肝素，最后用碳酸氫鈉將pH值調至7.3~7.6。最后在培養基中加入20μg/L的bFGF和20μg/L的EGF，放在 37℃含有體積分數為5% CO2的培養箱內培養。細胞生長較滿時，不用胰蛋白酶消化，采用機械方法分離細胞，離心棄上清，再種植到培養板上傳代培養。2~3d換一半培養液，加入 bFGF和EGF使其終濃度為20μg/L 。細胞也可以在B27（1:50）培養基培養，即用B27替代N2，其它成分相同，也能獲得相同的增殖效果。細胞可以用常規方法液氮凍存、復蘇，凍存培養基為N2加入100g/L的胎牛血清。

懸浮培養的細胞種植到經多聚賴氨酸處理的培養皿中，培養基為含有20g/L FBS的DMEM/F12/N2。經一段時間的培養后進行免疫細胞化學檢查。 0.01M PBS洗去培養液，4g/L的多聚甲醛固定 15min；PBS洗3次，每次5min； 2.5g/L Triton X-100處理15min；PBS洗3次，每次5min；含有1g/L馬血清的一抗37℃處理1.5h，4℃過夜；PBS洗 3次，每次5min；以后步驟按試劑盒說明書進行，染色直接在顯微鏡下觀察、記數、照相。記數每種神經細胞標志物陽性細胞的比例（顯微鏡下計數200個細胞中陽性細胞數，分別隨機計數5次，實驗重復3次）。

原代培養分離的細胞形態大小不一，培養皿內培養48h，可見細胞開始聚集成球，形成類似神經干細胞的神經球（neurosphere），細胞可以成懸浮狀態、半懸浮狀態或貼壁生長，隨著培養時間的延長可見神經球增大，貼壁細胞長出突起（圖1）。神經球周邊細胞較亮，中心區細胞密度高，透光度差。細胞的生長速度與種植密度密切相關，細胞密度較高時分裂速度快，密度較低時（1000~10000/cm2），細胞分裂速度明顯減慢。神經球較大時生長受限制，必需及時傳代，將神經球分離成單細胞，再加入培養基進行傳代培養，但在此過程中有大量的細胞死亡，可能由于傳代過程中對細胞的機械損傷所致，培養的細胞在體外至少可維持2個月，增殖約10~15倍。

膠質瘤干細胞的分化：神經球吸管吹打分散后種植在多聚賴氨酸處理的培養皿上，因神經球細胞結合緊密，大部分細胞仍呈球形狀態，少數細胞分散為單細胞。貼壁后早期為圓形細胞，發出的突起多為2個，少有3個以上突起；貼壁時間較長時（如20d），孤立的細胞開始分化為終末細胞，呈現為典型的神經元或膠質細胞的形態。種植2d后進行免疫細胞化學檢查，接近100%的細胞表達巢蛋白和波形蛋白，表明它們的神經干細胞屬性。巢蛋白的陽性部位是胞質中，早期伸出的突起也呈陽性表達，細胞核無表達。波形蛋白的表達部位與波形蛋白類似。分離的細胞貼壁后加入含20g/L FBS的DMEM/F12/N2培養基，不加bFGF和EGF，繼續培養10d，細胞固定后行免疫細胞化學檢查。部分細胞分化為典型的神經元形態，表達β Ⅲ型管蛋白。NF200陽性細胞的形態也多樣，可以是神經元的形態，也有膠質細胞樣細胞表達NF200。分化的大部分細胞為GFAP陽性細胞，細胞呈多角、不規則形或成纖維細胞形態，這類細胞S100也陽性表達，GFAP陽性細胞也有些具有典型的神經元的形態。

為什么腫瘤是異質性的，從細胞表型和增殖潛能的角度來說，一些腫瘤可能起源于一小群腫瘤干細胞，由它們產生不同表型的增殖潛能不強的腫瘤細胞。這些腫瘤干細胞可能由于正常的干細胞自我更新失調發生突變所致。.在人類的白血病，腫瘤克隆的組織是有層次性的，起源于數量極少的白血病干細胞，這種細胞擁有廣泛的增殖和自我更新能力，它們對維持腫瘤的克隆是必需的。近來的研究證明，不僅在胚胎期的腦組織中存在神經干細胞，在很多的成年的哺乳動物腦室下區，齒狀回能持續產生神經元[4]，神經干細胞在成人腦中分離培養成功，向膠質瘤起源細胞的傳統學說發出了挑戰。神經節膠質細胞瘤、少突膠質細胞瘤和星形膠質細胞瘤等可能來自相應的前體細胞；神經干細胞移植后的潛在致瘤性、神經干細胞轉基因后變為膠質瘤，這些實驗結果支持膠質瘤起源于中樞神經內的具有增殖和分化潛能的干細胞或前體細胞，但尚未找到確鑿的直接證據。大鼠胚胎腦組織來源的神經干細胞能夠表達其它胚層（如垂體）相關的轉錄因子和標志物，這說明在合適的刺激條件下，神經干細胞不僅能夠分化為神經細胞，也可以分化為大腦內不存在的其它細胞，它們具有一定的多能性。這提示神經干細胞異常突變導致膠質瘤發生的可能。