脈沖場凝膠電泳制備DNA（酵母完整DNA的分離）

酵母混懸培養物

細胞清洗緩沖液 EDTA L 緩沖液 TE 酵母裂解緩沖液 酵母細胞壁消化酶 酶解酶

低熔點瓊脂糖 Sorvall GSA 轉頭或相當型號的轉頭 預成型的 Plexiglas 模具

一、材料

1. 緩沖液和溶液

細胞清洗緩沖液（0.01 mol/L Tris-Cl ( pH 7.6)，0.05 mol/L EDTA ( pH 8.0)，室溫存放。）

EDTA ( 0.05 mol/L, pH 8.0)

L 緩沖液（0.1 mol/L EDTA ( pH 8.0)，0.01 mol/L Tris-Cl ( pH 7.6)，0.02 mol/L NaCl，4℃ 存放）

含蛋白酶 K 和十二烷基肌氨酸鈉（Sarkosyl) 的 L 緩沖液

TE（pH 7.6）

含 40 μg/ml PMSF 的 TE（pH 7.6）

酵母裂解緩沖液（0.01 mol/L Tris-Cl（pH 7.6），0.5 mol/L EDTA（pH 8.0），β-巰基乙醇（1% V/V））

酵母細胞壁消化酶

酶解酶（Zymolyase）5000（Kirin Breweries）或溶細胞酶（Lyticase）（67 mg/ml）（Sigma）

2. 凝膠

低熔點瓊脂糖（1%）

3. 離心機和轉頭

Sorvall GSA 轉頭或相當型號的轉頭

4. 專用設備

預成型的 Plexiglas 模具（50~100 μl，Pharmacia 或 Bio-Rad), 或一個長的 Tygon 管（1/8 英寸或內徑 3.2 mm), 或一個塑料注射器（1 ml）。

5. 細胞和組織

酵母混懸培養物

二、方法

1. 3000 g ( Sorvall GSA 轉頭 4300 r/min) 4℃ 離心 5 min 收集混懸培養的酵母細胞。用細胞清洗緩沖液洗兩次細胞沉淀。

2. 混懸細胞于 0℃ 的 0.05 mol/L EDTA（pH 8.0）中，濃度 3X10⁹ 個細胞/ml。

3. 用 L 緩沖液配制 1% 低熔點瓊脂糖。熔化后，冷卻至 42℃。

4. 加 75 μl 酶解酶或溶細胞酶溶液到步驟 2 的細胞混懸液內，混勻。

5. 加熱細胞混懸液至 42℃。將 5 ml 熔化的瓊脂糖和 5 ml 細胞混懸液混合。用一個封口的巴斯德吸管攪勻混合物，以保證細胞完全分散在瓊脂糖中。

6. 混合物移入預成形的 Plexiglas 模具（50~100 μl，Pharmacia 或 Bio-Rad), 或吸混合物到合適長度的 Tyson 管（內徑 3/32 英寸）內，也可以吸入 1 ml 塑料注射器內。室溫放置 15 min，再移至 4℃ 放 15~30 min。

7. 瓊脂糖凝固后，從 Plexiglas 模具收集凝膠栓，或從 Tygon 管和注射器擠出凝膠。將圓柱形凝膠栓切成 1 cm 長的段。

8. 3 倍體積酵母裂解緩沖液內 37℃ 溫育凝膠塊 3 h，化學通風櫥內進行。

9. 干凈培養皿內加入 3 倍體積含有 0.1 mg/ml 蛋白酶 K 和 1% ( m/V）Sarkosyl 的 L 緩沖液。移入凝膠塊，50℃ 溫育 3 h。用新鮮等體積上述緩沖液替換舊的，繼續 50℃ 溫育 12~16 h。

10. 在 50 倍體積含 40 μg/ml PMSF 的 TE ( pH 7.6) 50℃ 溫育凝膠塊 1 h。用新鮮等體積上述溶液替換舊的，繼續 50℃ 溫育 1 h。

11. 除去含 PMSF 的 TE, 用新鮮等體積 TE ( pH 7.6) 室溫繼續溫育 1 h。