苯酚法制備酵母tRNA

DEAE 纖維素   二乙醇胺 (TEA) 溶液 0.lmol LTEA 緩沖液  0.lmol L 氯化鈉含 0.lmoi. LTEA 緩沖液  12mol L 氯化鈉含 0.lmol LTEA 緩沖液  lmol L 氯化鈉含 0.lmol LTEA 緩沖液   乙醚  水飽和酚 乙醇

皂土 電動攪拌器   離心機  部分收集器   紫外分光光度計

一 材料與設備

1)DEAE 纖維素：稱取 20 g 交換量 l.Ommol/gDEAE 纖維素，先用 300 ml0.5mol/L 氫氧化鈉浸泡 1?2 h 攪拌, 傾去上清液后水洗至中性。

2) 二乙醇胺 (TEA) 溶液：先用濃 HC1 調至 pH7.4, 然后稀釋成 lmol/L 作為儲液。

3)0.lmol/LTEA 緩沖液 (pH7.4)

4)0.lmol/L 氯化鈉含 0.lmoi./LTEA 緩沖液，pH7.4,

5)12mol/L 氯化鈉含 0.lmol/LTEA 緩沖液，pH7.4。

6)lmol/L 氯化鈉含 0.lmol/LTEA 緩沖液，pH7.4。

7) 乙醚。

8) 水飽和酚。

9) 乙醇，

10) 皂土

11) 電動攪拌器。

12) 離心機，

13) 部分收集器。

14) 紫外分光光度計。


二 操作方法

1)250 g 新鮮面包酵母，加入 375 ml 蒸餾水，攪勻成糊狀。

2) 再加入 500 ml90% 苯酚（改變細胞透性，使蛋白變性），電動攪拌 lh 后，放置于冰箱中過夜。

3)4000r/min 離心 15 min, 棄去上清液，下層為酚相，小心吸出后 (避免吸入蛋白質），每升加 20 g 乙酸鉀和 2L 乙醇使 tRNA 沉淀，-20°C 過夜。

4)4000r/nin 離心 15 min。棄去上清液，沉淀用 95% 乙醇洗一次，4000r./min 離心15 min

5) 沉淀再用乙醚洗一次，4000r/min 離心 15 min

6) 沉淀溶于 25 ml0.1mol/LTEA 緩沖液中. 加入 0.025 g 皂土，1.5 g 氯化鈉，0°C 靜置 lh，4000r/min 離心 15 min。

7) 上清液用 0.1mol/I.TEA 緩沖液稀釋 10 倍，上樣到已用的含 0.lmol/LNaCl 的0.lmol/LTEA 緩沖液平衡的 DEAE 纖維素柱. 用含 0.2mol/LNaCl 的 TEA 洗滌，至流出液的 OD260<0.05 為止。

8) 用含 1mol/LMaCl 的 TEA 洗脫，分部分收集, 測定其 OD260，取其峰值部分的液體

9) 加 2 倍體積 95% 乙醇，一 20℃ 過夜（或 2 h)

10)4000r/min 離心 15 min。上清液棄去，沉淀以 67% 乙醇，95% 乙醇，無水乙醇及乙醚各洗一次。

11)4000r/mim 離心, 沉淀真空干燥，電泳檢測 tRNA,