一、背景知識
藥品質量標準分析方法驗證的目的是證明采用的方法適合于相應的檢測要求,在建立藥品質量標準時,分析方法需經驗證;在藥品生產工藝變更、制劑的組分改變、原分析方法進行修訂時,質量標準分析方法也需要進行驗證,該驗證過程亦被稱為方法再驗證,方法再驗證的內容可以是全面驗證或是部分驗證。方法再驗證理由、過程和結果均應記載在藥品標準起草或修訂說明中。
需驗證的分析項目有:鑒別試驗,雜質定量或限度檢查,原料藥或制劑中有效成分含量測定,以及制劑中有效成分含量測定,以及制劑中其他成分(如防腐劑等)的測定。藥品溶出度、釋放度等檢查中,其溶出量等的測試方法也應作必要驗證。驗證內容有:準確度、精密度(包括重復性、中間精密度和重現性)、專屬性、檢測限、定量限、線性、范圍和耐用性。視具體方法,擬定需要驗證的內容。
二、知識儲備
1、準確度
準確度系指用該方法測定的結果與真實值或參考值接近的程度,一般用回收率(%)表示。準確度應在規定的范圍內測試。
(1)含量在測定方法的準確度
①原料藥的含量測定
可用已知純度的對照品或供試品進行測定,并按下式計算回收率;或用本法所得的結果與已知準確度的另一方法測定的結果進行比較。
如該分析方法已經測試并求得精密度、線性和專屬性,在準確度無法直接測試(采用對照品對照法計算含量的方法,如高效液相色譜法)或可推算出的情況下,該項目可不再進行驗證。
②制劑的含量測定
主要測試制劑中其他組分及輔料對含量測定方法的影響。可用含已知量被測物的制劑各組分混合物(包括制劑輔料)進行測定,回收率的計算同原料藥的含量測定。如不能獲得制劑的全部組分,則可向制劑中加入已知量的被測物進行測定,回收率則應按下式計算;或用本法所得的結果與已知準確度的另一方法測定的結果進行比較。
(2)雜質定量測定方法的準確度
雜質定量測定方法多采用色譜法,其準確度可通過向原料藥或制劑中加入已知量雜質進行測試。如不能獲得雜質或降解產物,可用本法測定結果與另一成熟的方法進行比較,如藥典標準方法或經過驗證的方法。在不能測得雜質或降解產物的響應因子或不能測得其對原料藥的相對響應因子的情況下,可用原料藥的響應因子。同時,應明確表示單個雜質和雜質總量相當于主成分的重量比(%)或面積比(%)。
(3)數據要求
在規定范圍內,至少用9個測定結果進行評價。例如,設計3個不同濃度,每個濃度各制備3份供試品溶液,進行測定。比如一般要求分別配制濃度為80%、100%和120%的供試品溶液各3份,分別測定其含量,將實測值與論值比較,計算回收率。應報告已知加入量的回收率(%),或測定結果的平均值與真實值之差及其相對標準偏差或可信限。
2.精密度
精密度系指在規定的測試條件下,同一個均勻供試品,經多次取樣測定所得結果之間的接近程度。精密度一般用標準偏差(standard deviation,s或SD)或者相對標準偏差(relative standard deviation,RSD)表示,其計算式如下。
精密度是考察分析方法在不同時間、由不同人員操作,或在不同的實驗室所獲得的結果重復性或重現性。涉及定量測定的項目,如含量測定和雜質定量測定均應驗證方法的精密度。
(1)驗證內容
精密度驗證內容包括重復性、中間精密度和重現性。
①重復性
在較短的時間間隔內,在相同的操作條件下,由同一分析人員連續測定所得結果的精密度稱為重復性,也稱批內精密度或日內精密度。
在規定“范圍”內,至少用9個測定結果進行評價。例如,制備3個不同濃度的樣品,每個濃度分別制備3份供試品進行測定;或將相當于100%水平的供試品溶液,用至少測定6次的結果進行評價。
②中間精密度
在同一個實驗室,由于實驗室內部條件的改變,如不同時間不同分析人員用不同設備測定所得結果之間的精密度,稱為中間精密度。其中,由不同分析人員用同一設備測定所得結果的中間精密度通常稱為批間精密度或日間精密度。
為考察隨機變動因素對精密度的影響,應設計方案進行中間精密度試驗。變動因素為不同日期、不同分析人員、不同設備。
③重現性
在不同實驗室由不同分析人員測定結果之間的精密度,稱為重現性。
法定標準采用的分析方法應進行重現性試驗。如建立藥典分析方法時通過協同檢驗得出重現性結果,協同檢驗的目的、過程和重現性結果均應記載在起草說明中,應注意重現性試驗用樣品本身的質量均勻性和貯存運輸中的環境因素,以免影響重現性結果。
(2)數據要求
精密度驗證中所測數據均應報告標準偏差相對標準偏差和可信限。
3.專屬性
專屬性系指在其他成分(如雜質、降解產物、輔料等)可能存在下,采用的方法能正確測定出被測物的特征。鑒別反應、雜質檢查和含量測定的方法,均應考察其專屬性。如方法不夠專屬,應采用多個方法予以補充。
(1)鑒別反應
應能與可能共存的物質或與結構相似化合物區分,不含被測成分的供試品,以及結構相似或組分中的有關化合物,均應呈負反應。
(2)含量測定和雜質測定
色譜法和其他分離方法應附代表性圖譜,以說明方法的專屬性,并應表明諸成分在圖中的位置,色譜法中的分離度應符合要求。
在雜質可獲得情況下,對于含量測定,試樣中可加入雜質或輔料,考察測定結果是否受干擾,并可與未加雜質和輔料的試樣比較測定結果;對于雜質測定,也可向試樣中加入一定量的雜質,考察雜質之間能否得到分離。
在雜質或降解產物不能獲得的情況下,可將含有雜志或降解產物的試樣進行測定,與另一個經驗證了的方法或藥典方法比較結果;用強光照射、高溫、高濕、酸(堿)水解或氧化的方法進行加速破壞,以研究可能的降解物質及其降解途徑,含量測底方法應比對二法的結果,雜質檢查應比對檢出的雜質個數,必要時可采用光二極管陣列檢測和質譜檢測,進行純度檢查。
4.檢測限
檢測限(limit of detection,LOD)是指試樣中被測物能檢測出的最低濃度或量。LOD是一種限度檢驗效能指標,它反映方法是否具有靈敏的檢測能力,即是否具備足夠的靈敏度。它無需準確定量,只要指出高于或低于該規定的濃度或量即可,藥品的鑒別試驗和雜質檢查方法均應通過測試確定方法的檢測限。
(1)常用的方法
①目視法
用已知濃度的被測物,通過目視法試驗出能被可靠地檢測出的最低濃度或量。本法適用于可用目視法直接評價結果的分析方法,通常為非儀器分析法,如鑒別試驗的顯色法、雜質檢查的薄層色譜法(TLC)等。
②信噪比法
用已知低濃度試樣測出信號與空白樣品測出的信號(基線噪聲)進行比較,計算出能被可靠地檢測出的最低濃度或量,一般以信噪比(S/N)3:1或2:1時的相應濃度或注入儀器的量確定LOD值。本法適用于能直觀顯示信號與基線噪聲水平(強度)的儀器分析方法。
③標準偏差法
用空白樣品進行分析,求其背景響應值的標準偏差S空,再將3倍空白標準偏差作為檢測限的估算值。本法適用于不能直觀比較信噪比的儀器分析方法,如紫外分光光度法。計算得到的LOD值與實際測得的LOD值相一致,可按下式進行校正。
式中,f為校正因數(系將吸光度值單位轉換為濃度單位);C樣為低濃度樣品溶液的濃度值;A樣為低濃度樣品溶液的吸光度值。
(2)數據要求
無論用何種方法,均應用一定數量(如6份)的試樣,其濃度為近于或等于檢測限目標值,進行分析,以可靠地測定檢測限,檢測限的數據應附測試圖譜,說明測試過程和檢測限結果。
5.定量限
定量限(limit of quantitation,LOQ)系指試樣中被測物質能被定量測定的最低量,其測定結果應具有一定準確度和精確度,LOQ體現分析方法是否具備靈敏的定量檢測能力。雜質和降解產物用定量測定方法研究時,應確定方法的LOQ。
LOQ的測定方法與LOD測定方法相同,只是相應的系數(倍數)不同,因為有關物質定量測定通常選用HPLC法,所以LOQ的確定常用信噪比法,可通過不同濃度(在低濃度區)的試樣測定響應信號后,計算信噪比法S/N=10時的相應濃度或注入儀器的量確定定量限。
數據要求:附測試圖譜,并說明測試過程和定量限,以及測試結果的準確度與精密度。
6.線性
線性系指在設計的“范圍”內,測試結果(響應值)與試樣中被測物濃度直接呈正比關系的程度,線性是定量測定的基礎,涉及定量測定的項目,如含量測定和雜質定量檢查均需驗證線性。
應在規定的“范圍”內測定線性關系。可用一貯備液經精密稀釋,或分別精密稱樣,制備一系列(至少5份)供試樣品的方法進行測定。以測得的響應信號作為被測物濃度的函數作圖,觀察是否呈線性,再用最小二乘法進行線性回歸。必要時,響應信號可經數學轉換,再用線性回歸計算。
數據要求:應列出回歸方程、相關系數和線性圖。
7.范圍
范圍系指能達到一定精密度、準確度和限性、測試方法適用的高低限濃度或量的區間。范圍是規定值,應在試驗研究開始前確定驗證的范圍和試驗方法。可以采用符合要求的原料藥配制成不同的濃度,按照相應的測定方法進行試驗。
涉及定量測定的檢測項目均需要對范圍進行驗證,如含量測定、含量均勻度、溶出度或釋放度,以及特殊元素或特殊雜質的定量檢查等。
范圍應根據分析方法的具體應用和線性、準確度、精密度結果和要求確定。
(1)原料藥和制劑含量測定
范圍應為測試濃度的80%～120%。
(2)制劑含量均勻度檢查
范圍應為測試濃度的70%～130%,根據劑型特點,如氣霧劑和噴霧劑,范圍可適當放寬。
(3)溶出度或釋放度中的溶出量測定
范圍應為限度值的±20%,如規定了限度范圍,則應為下限的-20%至上限的+20%。如規定了數個限度范圍,則應為最低下限的-20%至最高上限的+20%。
(4)特殊元素含量測定范圍
范圍應為限度值的±20%,如規定了限度范圍,則應為下限的-20%至上限的+20%。
(5)雜質測定
范圍應根據初步實測,擬定為規定限度的±20%。如果雜質檢查與量測定同時進行,且用峰面積按百分歸一化法計算,則線性范圍應為雜質規定限度的一20%至含量限度(或上限)的+20%。
8.耐用性
耐用性系指在測定條件有小的變動時,測定結果不受影響的承受程度。耐用性表明測定結果的偏差在可接受范圍內,測定條件的最大允許變動范圍。為使分析方法可為常規檢驗提供依據,開始研究分析方法時,就應考慮其耐用性。如果測試條件要求苛刻,則應在方法中寫明。
典型的變動因素有:被測溶液的穩定性,樣品提取次數、時間等。液相色譜法中的典型變動因素有:流動相的組成比例和pH值、不同廠牌或不同批號的同類型色譜柱、柱溫、流速等。氣相液相色譜法變動因素有:不同廠牌或批號的色譜柱、固定相、不同類型的擔體、主溫、進樣口和檢測器溫度等。
經試驗,應說明小的變動能否通過設計的系統實用性試驗,以確保方法有效。