菌種保藏的方法（一）

  菌種是主要的生物資源，也是食用菌生產首要的生產資料。一個優良的菌種被選育出來以后，必須保持其優良性狀不變或盡可能地少變慢變，才不至于降低生產性能，能長期在生產中使用。因此，菌種保藏在食用菌生產上具有重要的意義。
　　
　　各種微生物由于遺傳特性不同，因此適合采用的保藏方法也不一樣。一種良好的有效保藏方法，首先應能保持原菌種的優良性狀長期不變，同時還須考慮方法的通用性、操作的簡便性和設備的普及性。下面介紹幾種常用的菌種保藏方法：
　　
　　（一）斜面低溫保藏法
　　
　　將菌種接種在適宜的斜面培養基上，待菌種生長完全后，置于4℃左右的冰箱中保藏，每隔一定時間（保藏期）再轉接至新的斜面培養基上，生長后繼續保藏，如此連續不斷。此法廣泛適用于細菌、放線菌、酵母菌和霉菌等大多數微生物菌種的短期保藏及不宜用冷凍干燥保藏的菌種。放線菌、霉菌和有芽孢的細菌一般可保存6個月左右，無芽孢的細菌可保存1個月左右，酵母菌可保存3個月左右。如以橡皮塞代替棉塞，再用石蠟封口，置于4℃冰箱中保藏，不僅能防止水分揮發、能隔氧，而且能防止棉塞受潮而污染。這一改進可使菌種的保藏期延長。
　　
　　此法由于采用低溫保藏，大大減緩了微生物的代謝繁殖速度，降低突變頻率；同時也減少了培養基的水分蒸發，使其不至于干裂。該法的優點是簡便易行，容易推廣，存活率高，故科研和生產上對經常使用的菌種大多采用這種保藏方法。其缺點是菌株仍有一定程度的代謝活動能力，保藏期短，傳代次數多，菌種較容易發生變異和被污染。
　　
　　（二）石蠟油封藏法
　　
　　此法是在無菌條件下，將滅過菌并已蒸發掉水分的液體石蠟倒入培養成熟的菌種斜面（或半固體穿刺培養物）上，石蠟油層高出斜面頂端lcm，使培養物與空氣隔絕，加膠塞并用固體石蠟封口后，垂直放在室溫或4℃冰箱內保藏。使用的液體石蠟要求優質無毒，化學純規格，其滅菌條件是：150～170℃烘箱內滅菌lh；或121℃高壓蒸汽滅菌60～80min，再置于80℃的烘箱內烘干除去水分。
　　
　　由于液體石蠟阻隔了空氣，使菌體處于缺氧狀態下，而且又防止了水分揮發，使培養物不會干裂，因而能使保藏期達1～2年，或更長。這種方法操作簡單，它適于保藏霉菌、酵母菌、放線菌、好氧性細菌等，對霉菌和酵母菌的保藏效果較好，可保存幾年，甚至長達10年。但對很多厭氧性細菌的保藏效果較差，尤其不適用于某些能分解烴類的菌種。
　　
　　有試驗指出，此法用于保藏紅曲霉很合適，保藏1～2年后存活率為100％；也有報道顯示，某些蕈菌菌絲用石蠟油保藏法，在3～6℃保藏時菌絲易于死亡，而在室溫下反而較理想，這是值得注意的。
　　
　　（三）砂土管保藏法
　　
　　這是一種常用的長期保藏菌種的方法，適用于產孢子的放線菌、霉菌及形成芽孢的細菌，對于一些對干燥敏感的細菌如奈氏球菌、弧菌和假單胞桿菌及酵母則不適用。
　　
　　其制作方法是，先將砂與土分別洗凈、烘干、過篩（一般砂用60目篩，土用120目篩），按砂與土的比例為（1～2）：1混勻，分裝于小試管中，砂土的高度約1cm，以121℃蒸汽滅菌1～1.5h，間歇滅菌3次。50℃烘干后經檢查無誤后備用。也有只用砂或土作載體進行保藏的。需要保藏的菌株先用斜面培養基充分培養，再以無菌水制成108～1010個/ml菌懸液或孢子懸液滴入砂土管中，放線菌和霉菌也可直接刮下孢子與載體混勻，而后置于干燥器中抽真空約2～4h，用火焰熔封管口（或用石蠟封口），置于干燥器中，在室溫或4℃冰箱內保藏，后者效果更好。
　　
　　砂土管法兼具低溫、干燥、隔氧和無營養物等諸條件，故保藏期較長、效果較好，且微生物移接方便，經濟簡便。它比石蠟油封藏法的保藏期長，約1～10年。中國科學院微生物研究所用砂土管保藏法保藏放線菌。
　　
　　（四）麩皮保藏法
　　
　　麩皮保藏法亦稱曲法保藏。即以麩皮作載體，吸附接入的孢子，然后在低溫干燥條件下保存。其制作方法是按照不同菌種對水分要求的不同將麩皮與水以一定的比例1：（0.8～1.5）拌勻，裝量為試管體積2/5，濕熱滅菌后經冷卻，接入新鮮培養的菌種，適溫培養至孢子長成。將試管置于盛有氯化鈣等干燥劑的干燥器中，于室溫下干燥數日后移入低溫下保藏；干燥后也可將試管用火焰熔封，再保藏，則效果更好。
　　
　　此法適用于產孢子的霉菌和某些放線菌，保藏期在1年以上。因操作簡單，經濟實惠，工廠較多采用。中國科學院微生物研究所采用麩皮保藏法保藏曲霉，如米曲霉、黑曲霉、泡盛曲霉等，其保藏期可達數年至數十年。