蛋白純化常見問題總結（二）

3)Sephadex G-25(medium)柱脫鹽時，鹽濃度太高對柱效有影響嗎?若有，一般對鹽濃度限度如何?

大家別客氣，除鹽對于濃度應該也是有一定的限制的，同樣的樣品鹽濃度高的自然要比濃度低的要在柱子上走的峰要寬些，相對需要的柱子的分辨率也要高點，但是在正常的范圍如1-2M應該影響不大，不過要除得很干凈還是盡量少上點樣品，我覺得上樣的體積畢竟比濃度的影響更大。

4)我的蛋白17kd左右，能跟肝素親和，一般用離子交換和親和層析純化，現在我用聚乙二醇修飾它，分子量增加5000左右，修飾率不可能達到100%，請問修飾后能用什么純化方法可以把修飾的和未經修飾的分開?(當然修飾后還殘留有聚乙二醇，這個小分子也要除掉)

他們大多用凝膠過濾，我覺得這也不錯的做法，畢竟PEG是鏈狀的分子，在柱子上和普通蛋白行為不一樣，修飾度越高那么出峰也越后，因此你的蛋白選擇sephadex G50試試，它的范圍在1000-30000，應該是不錯的選擇。此外PEG是個疏水性的鏈，修飾后的蛋白疏水性增強，修飾度越高，疏水性越強，可以用這個原理分離。離子交換也可以選擇，因為同樣道理，修飾度越高，電荷被屏蔽也越多，電荷也越少，因此應該修飾度越高越先出。親和也離子交換一樣的道理，你可以試試，你手頭的親和能不能分開，你在這幾個方法里選擇看哪個更經濟好用就可以。

5)我有個問題困繞很久，從細菌中提取酶，好像用常規的方法(超聲波破壁，緩沖液提取)，總是拿不到我要的蛋白。是不是這種蛋白也是疏水性較強，需要加助溶劑才能提取出來?另外，我是不是也可以加點甘油或者PEG來提取?

其實這個問題我覺得是這樣的，既然你是提取那肯定是有沉淀和上清，你的目標蛋白的分子量你是應該知道的，那么跑電泳先看它到底是在上清還是沉淀里，剩下的問題你再解決如何提取。

對于不同的酶要看酶穩定如何，你可以用不同的PH去提取，我曾經提取一個酶用水就是提取不出來，需要用鹽才能提取出來，多試試，設計個方案，這樣才能解決問題，所以不一定加甘油就管用，你還得注意破碎本身會不會有問題，倒回去做做也許能找到真正的原因。有什么問題繼續探討。

6)HPLC是用來分析檢測或分離純化?

如果可以用來純化，上樣量那么小有什么意義呢?

如果是用來分析檢測，怎樣指導以后的分離純化工作呢?

HPLC既可以做分析也可以做制備，純化上樣量小，這樣分離效果好，就可能得到很純的物質，同時配合質譜等就可以得到很多單一蛋白的特性包括序列等，這些純度高的組分是用一般的純化方法做不到的。HPLC重現性好，定量準確，所以也可以用于定量和定性，是分析中不可缺少的工具。

分析出來后如果這個物質很穩定，直接線性放大就可以做大規模的制備，因此摸好了分析的條件也就相應有了制備的條件。