蛋白質含量的測定——考馬斯亮藍（CoomassieBrilliantBlue）...

實驗原理

考馬斯亮藍（Coomassie Brilliant Blue）法測定蛋白質濃度，是利用蛋白質―染料結合的原理，定量的測定微量蛋白濃度的快速、靈敏的方法。這種蛋白質測定法具有超過其他幾種方法的突出優點，因而正在得到廣泛的應用。這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質測定法。

考馬斯亮蘭G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質結合，使染料的最大吸收峰（lmax）的位置，由465nm變為 595nm，溶液的顏色也由棕黑色變為蘭色。通過測定595nm處光吸收的增加量可知與其結合蛋白質的量。研究發現，染料主要是與蛋白質中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結合。

考馬斯亮藍染色法的突出優點是：

（1）靈敏度高，據估計比Lowry法約高四倍，其最低蛋白質檢測量可達1mg。這是因為蛋白質與染料結合后產生的顏色變化很大，蛋白質－染料復合物有更高的消光系數，因而光吸收值隨蛋白質濃度的變化比Lowry法要大的多。

（2）測定快速、簡便，只需加一種試劑。完成一個樣品的測定，只需要5分鐘左右。由于染料與蛋白質結合的過程，大約只要2分鐘即可完成，其顏色可以在1小時內保持穩定，且在5分鐘至20分鐘之間，顏色的穩定性最好。因而完全不用像Lowry法那樣費時和嚴格地控制時間。

（3）干擾物質少。如干擾Lowry法的K+、Na+、Mg2+離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA等均不干擾此測定法。

此法的缺點是：

（1）由于各種蛋白質中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此考馬斯亮藍染色法用于不同蛋白質測定時有較大的偏差，在制作標準曲線時通常選用g—球蛋白為標準蛋白質，以減少這方面的偏差。

（2）仍有一些物質干擾此法的測定，主要的干擾物質有：去污劑、 Triton X-100、十二烷基硫酸鈉（SDS）等。

試劑與器材

一、試劑

考馬斯亮藍試劑：

考馬斯亮藍G―250 100mg溶于50mL 95%乙醇中，加入100mL 85%磷酸，用蒸餾水稀釋至1000mL。

二、標準和待測蛋白質溶液

1．標準蛋白質溶液

結晶牛血清蛋白，預先經微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量，根據其純度用0.15mol/L NaCl配制成1mg/mL蛋白溶液。

2．待測蛋白質溶液。

人血清，使用前用0.15mol/L NaCl稀釋200倍。

三、器材

試管1.5×15cm（×6），試管架，移液管管0.5mL（×2）；1mL（×2）；5mL（×1）；恒溫

水浴；分光光度計。

操作方法

一、制作標準曲線

取7支試管，按下表平行操作。

繪制標準曲線：以A595nm為縱坐標，標準蛋白含量為橫坐標，在坐標紙上繪制標準曲線。

二、未知樣品蛋白質濃度測定

測定方法同上，取合適的未知樣品體積，使其測定值在標準曲線的直線范圍內。根據所測定的A595nm值，在標準曲線上查出其相當于標準蛋白的量，從而計算出未知樣品的蛋白質濃度（mg/mL）。

注意事項
在試劑加入后的5－20min內測定光吸收，因為在這段時間內顏色是最穩定的。
測定中，蛋白－染料復合物會有少部分吸附于比色杯壁上，測定完后可用乙醇將藍色的比色杯洗干凈。