蛋白質定量實驗_考馬斯亮藍蛋白質濃度分析法

蛋白質分子中的芳香族氨基酸酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基，其化學結構中的共軛雙鍵，具有吸收紫外光的特性，吸收高峰在280 nm處，蛋白質溶液的吸光度(A280)與蛋白質含量成正比關系，可作為樣品中蛋白質定量測定。該方法簡便、靈敏、快速，且樣品用量少且可回收，低濃度的鹽類也不干擾測定，但測定的準確度比Lowry法低，這是由于對于測定那些與標準蛋白質中酪氨酸和色氨酸殘基含量差異較大的蛋白質時有一定的差距。若樣品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物質，會出現較大的誤差。

蛋白樣品

考馬斯亮藍 G250乙醇磷酸

紫外分光光度計

(1) 準備 100~1500 ug/ml 的標準品, 溶于 Bradford 法相兼容緩沖液中。對于較稀的樣品，可能通過增加樣品在試劑體積中的比率而擴大靈敏度（microBradfordassay:1~25ug/mL)。如果樣品與染料的比值太高, 可能會增加反應混合物的 PH 而導致反應背景較高。

(2) 將標準品和待測樣品加人到一次性的比色皿中 (應該使用一次性的塑料比色皿或微孔板，因為染料會黏附到各種材料容器的表面上）。

(3)Bradford 試劑預熱至室溫。將 ImL 染料溶液加人到 25 uL 蛋白質樣品中，混勻，室溫孵育 10 min。

(4) 檢測 450rnn 和 595nm 處的吸光度 (可以使用 570~610nm 的基于濾光器的儀器，對檢測性能不會有明顯的降低）。

(5) 對 595 nm 處的數據作圖，或為提高在低反應值處的精度，對 595 nm/450 nm 的比率作圖。標準反應曲線可以擬合為一個多項式反應，由此可以估算出待測樣品的濃度值.

1. 測定液必須澄清，否則造成測定結果誤差。

2. 由于蛋白質的紫外吸收高峰常因pH的改變而變化，故應用紫外吸收法時要注意溶液的pH，最好與制定標準曲線時的pH一致。