試管凝集試驗

實驗概要

顆粒性抗原與相應抗體直接結合，在一定條件下，出現肉眼可見的凝集現象。試管法是用定量抗原懸液與一系列倍比稀釋的待檢病人血清混合，置37℃過夜靜止。根據每管內顆粒抗原凝集的程度，以判斷待檢血清中有無相應抗體及其效價。是一種半定量試驗。

主要試劑

1．診斷菌液：生物制品所有商品供應，包括傷寒沙門氏菌H或O菌液（所受診斷菌液多為70億／ml菌體，用前須按使用說明分別以0.9％生理鹽水稀釋至適當濃度，一般為10億菌體／ml）。

2．待檢血清：可以不加溫滅能，用生理鹽水做1：10稀釋。

3．生理鹽水：0.9％的生理鹽水。

主要設備

小試管，試管架，刻度吸管，恒溫水浴箱等。

實驗步驟

操作方法

1．排管并做標記：準備小試管8支，排列于試管架上，標明序號。

2．每管內加入生理鹽水0.5 ml。

3．稀釋被檢血清: 具體操作見表1.1

     ①吸取1:10待檢血清0.5ml加入第一管中，充分混勻，使血清稀釋成1:20。

     ②吸取上述1:20血清稀釋液0.5ml，放入第2管中，充分混勻，使血清稀釋成1:40。

     ③吸取上述1:40血清稀釋液0.5ml，放入第3管中，充分混勻，使血清稀釋成1:80。

     ④如此連續稀釋到第7管為止。

     ⑤第8管只加生理鹽水0.5ml，不加血清，作為生理鹽水對照。

     ⑥稀釋后，第1至第7管的血清稀釋度依次為1:20、1:40、1:80、1:160、1:320、1:640、1:1280。

 4．加入診斷菌液: 將診斷菌液分別加于每一試驗管及生理鹽水對照管，每管0.5ml。此時各排第1管至第7管的血清因加入等量菌液而又稀釋一倍。

 5．血清最后稀釋度: 1:40、1:80、1:160、1:320、1:640、1:1280、1：2560。

 6．振搖混勻、保溫: 將所有試管振搖、混勻后，置37℃溫箱或水浴過夜（或56℃2～4小時）以促進反應。

      表1?1                                                                  

                單位（ml）         1        2          3          4            5           6             7              8     

             0.9%生理鹽水      0.5    0.5       0.5       0.5        0.5        0.5          0.5           0.5

             1:10待檢血清       0.5     0.5      0.5        0.5        0.5        0.5          0.5         棄0.5

              血清稀釋度        1:20   1:40    1:80    1:160   1:320    1:640     1:1280       ——  

                TO(或TH)           0.5      0.5      0.5        0.5       0.5        0.5          0.5           0.5  

           最后血清稀釋度   1:40    1:80    1:160   1:320   1:640   1:1280   1:2560      陰性對照 

    *注:此種稀釋法為免疫學試驗中常用的“連續倍比稀釋法”。

結果觀察

1．觀察條件：有良好的光源和黑暗的背景

2．取出試管: 從溫箱或水浴箱中輕輕取出試管架，不要搖動試管。

3．觀察方法: 把試管舉起以觀察試管內的上清液濁度和管底凝集物，然后再輕搖試管，使凝集塊從管底升起（注意觀察凝集物的松軟程度、大小、
       均勻度等性狀）。最后按液體的清濁、凝塊的性狀記錄結果。

4．觀察順序：應先看鹽水對照管（8號管），此管應呈陰性，即不凝集（詳見結果記錄）。然后由1號管至7號管依次觀察。

結果記錄

1．      很強，上清液完全透明，細菌全部形成凝塊，沉于管底。

2．       強，上清液透明度達75％（微混），大部分細菌形成凝塊，沉于管底。

3．        中等強，上清液透明度達50％（較混濁），約50％細菌形成凝塊。

4．         弱，上清液透明度只達25％（混濁），僅有小部分細菌形成凝集。

5．    -     不凝集，液體均勻混濁，無凝集。輕輕搖動試管，細菌分散。

效價判定

1．一般以出現“ ”凝集的血清最高稀釋倍數作為該血清的凝集效價。

2．分別報告被檢血清對傷寒沙門菌H抗原（可用TH表示）或傷寒沙門菌O抗原（可用TO表示）的凝集效價。

3．若第一管仍無凝集現象應報＜1: 40。

4．若第7管仍呈“ ”或更強凝集現象應報＞1:2560。

臨床意義

        本法主要用于檢查血清中有無某種特異性抗原及其含量（效價）。以協助臨床診斷或供流行病學調查研究。例如：診斷傷寒和副傷寒的Widal reaction、診斷斑疹傷寒和恙蟲病等立克次體病的Weil-Felix reaction、診斷布氏菌病的Wright reaction。這些試驗對相應疾病的診斷具有一定的決定作用。

注意事項

1．抗原抗體比例必須適當，才能出現肉眼可見的反應。如果抗體濃度過高，會出現前帶現象，要對抗體進一步稀釋，需要與陰性加以鑒別。

2．判斷結果時，應在暗背景下透過強光逐管檢查。

3．液體混合：將兩種液體混合時，需用吸管連續吸取數次。吸液時吸管應深入液面下，以防吸進空氣。注液時應離開液面，以防產生氣泡或使液面溢出試管。

      注意溫度、PH值、電解質、振搖對試驗結果的影響。水浴箱的水面不要高出試管內液面，以利于試管內液體的對流，增加抗原與抗體的接觸。在放入水浴前振搖，可使抗原抗體充分混勻，增加抗原抗體的接觸。