質粒DNA的分離、純化和鑒定

材料、設備及試劑
　　一、材料
　　含質粒的E. coli DH5α或JM系列菌株，1.5ml塑料離心管(又稱eppendorf管),離心管架。
　　二、設備
　　微量取液器(20μl,200μl,1000μl)， 臺式高速離心機，恒溫振蕩搖床， 高壓蒸汽消毒器(滅菌鍋)， 渦旋振蕩器， 電泳儀，瓊脂糖平板電泳裝置和 恒溫水浴鍋等。
　　三、試劑
　　1、 LB液體培養基(Luria-Bertani) ：稱取蛋白胨(Tryptone)10 g，酵母提取物(Yeast extract) 5 g，NaCl 10 g，溶于800ml去離子水中，用NaOH調pH至7.5, 加去離子水至總體積1升,高壓下蒸氣滅菌20分鐘。
　　2、LB固體培養基：液體培養基中每升加12g瓊脂粉,高壓滅菌。
　　3、 氨芐青霉素(Ampicillin, Amp)母液：配成 50mg/ml水溶液, -20℃保存備用。
操作步驟
　　一、 細菌的培養和收集
　　將含有質粒T-vector的DH5α菌種接種在LB固體培養基(含50μg/ml Amp)中, 37℃培養12-24小時。用無菌牙簽挑取單菌落接種到5ml LB液體培養基(含50μg/ml Amp)中,37℃振蕩培養約12小時至對數生長后期。
　　二、 質粒DNA少量快速提取
　　1、 1-3ml過夜培養細胞液4℃下 12000g離心1-2分鐘。
　　2、去除上清液，菌體細胞懸浮于200μl 細胞懸浮液中,充分混合,并移入eppendorf管中。
　　3、 加200μl 細胞裂解液, 顛倒離心管數次,直到溶液變清亮。
　　4、加200μl 中和液,顛倒離心管數次。
　　5、4℃下12000g離心5分鐘，取上清液于新的eppendorf管中。
　　6、加1ml Wizard少量 DNA 純化樹脂,顛倒離心管數次以充分混勻。
　　7、取一次性注射器, 取出注塞,并使注射筒與Wizard微型柱連接,用移液槍將上述混合液加入注射筒中,并用注塞輕推,使混合物進入微型柱。
　　8、將注射器與微型柱分開,取出注塞, 再將注射筒與微型柱相連,加入2ml柱洗液,并用注塞輕推，使柱洗液進入微型柱。
　　9、取出微型柱置于eppendorf管中,離心2分鐘以除去微型柱中的柱洗液。
　　10、將微型柱放在一個新eppendorf管中，加50μl TE(或水)于微型柱中，靜止1分鐘后，4℃下12000g離心20秒。
　　11、丟棄微型柱，將eppendorf管中的質粒DNA貯于4℃或-20℃冰箱。