質粒DNA的瓊脂糖凝膠電泳（agarosegelelectrophoresis）

帶電荷的物質在電場中的趨向運動稱為電泳。電泳的種類多，應用非常廣泛，它已成為分子生物學技術中分離生物大分子的重要手段。瓊脂糖凝膠電泳由于其操作簡單、快速、靈敏等優點，已成為分離和鑒定核酸的常用方法。
實驗目的：掌握瓊脂糖凝膠電泳的原理，學習瓊脂糖凝膠電泳的操作。
實驗材料：質粒DNA、BAC、植物總DNA或它們的酶切產物。
實驗原理：在pH值為8.0~8.3時，核酸分子堿基幾乎不解離，磷酸全部解離，核酸分子帶負電，在電泳時向正極移動。采用適當濃度的凝膠介質作為電泳支持物，在分子篩的作用下，使分子大小和構象不同的核酸分子泳動率出現較大的差異，從而達到分離核酸片段檢測其大小的目的。核酸分子中嵌入熒光染料（如EB）后，在紫外燈下可觀察到核酸片段所在的位置。

實驗步驟：
（1）用膠帶將洗凈、干燥的制膠板的兩端封好，水平放置在工作臺上；
（2）調整好梳子的高度；
（3）稱取0.24 g瓊脂糖于30 ml 0.5×TBE中，在微波爐中使瓊脂糖顆粒完全溶解，冷卻至45-50oC時倒入制膠板中；
（4）凝膠凝固后，小心拔去梳子，撕下膠帶；
（5）將電泳樣品與溴酚藍混合后將樣品依次點入加樣孔中；pUC18 5μl ddH2O 3μl 溴酚藍2μl 共10μl于0.5ml tube中混合后點樣；
（6）將制膠板放入電泳槽中，加入電泳液，打開電泳儀，使核酸樣品向正極泳動；
（7）電泳完成后切斷電源，取出凝膠，放入0.5 μg/ml的溴化乙錠（EB）溶液中染色10－15 min，清水漂洗后置于紫外透射儀上觀察電泳結果，并照相記錄。
附注：
1．影響DNA在瓊脂糖凝膠中遷移速率的因素：
（1）DNA分子大小 遷移速率U與logN成反比（N為堿基對數目）。分子大小相等，電荷基本相等（DNA結構重復性）。分子越大，遷移越慢。等量的空間結構緊密的電泳快（超螺旋>線性DNA）。
（2）瓊脂糖濃度：logU=logU0 Krt 膠濃度，U為遷移率，U0 為DNA的自由電泳遷移率，t為膠濃度，Kr為介質阻滯系數。不同的凝膠濃度，分辨不同范圍的DNA 。Agarose： 0.5%： 1-30 kb； 0.7%： 0.8-12 kb ；1.2%： 0.4-7 kb； 1.5%： 0.2-3 kb.。
（3）DNA構象：一般遷移速率超螺旋環狀>線狀DNA>單鏈開環。當條件變化時，情況會相反，還與瓊脂糖的濃度、電流強度、離子強度及EB含量有關。
（4）所加電壓：低電壓時，線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。使分辨效果好，凝膠上所加電壓不應超過5V/cm 。
（5）堿基組成與溫度：一般影響不大4 -30 ℃ 。
（6）嵌入染料的存在：降低線性DNA遷移率，(不提倡加在電泳液中)。
（7）電泳緩沖液 （0.5×TBE）的組成及其離子強度影響DNA的遷移率，無離子存在時，核酸基本不泳動，離子強度過大產熱厲害，熔化凝膠并導致DNA變性，一般采用 1×TAE，1×TBE，1×TPE（均含EDTA pH8.0）。
2．溴化乙錠（EB）為致癌劑，操作時應戴手套，盡量減少臺面污染。
3．電泳指示劑：核酸電泳常用的指示劑有兩種，溴酚藍（bromophenol blue,Bb）呈藍紫色；二甲苯晴（xylene cyanol,Xc）呈藍色，它攜帶的電荷量比溴酚藍少，在凝膠中的的遷移率比溴酚藍慢。