質譜沙龍第二十期活動報道

　　2009年6月28日下午，質譜沙龍第二十期活動在北京師范大學分析測試中心舉行。來自發酵研究院、二炮總醫院、空軍總醫院、中科院植物所、AB公司、島津公司、北京大學分析測試中心的各位專家、學生20余人。

　

　　第二十期質譜沙龍活動現場

 

　　北京師范大學分析測試中心簡介及應用經驗介紹

　　來自北京師范大學分析測試中心的謝孟峽教授，先向大家介紹了北京師范大學分析測試中心和成立不久的質譜中心。

 

　　北京師范大學分析測試中心 謝孟峽教授

　　北京師范大學分析測試中心成立于上世紀八十年代，主要有三方面的工作任務分別是科學研究、教學和分析測試服務。現有固定工作人員30名左右，其中約40%具有博士學位，高級職稱人員占50%以上;1994年通過國家計量認證，2003年在高校率先實現質量體系轉換。

　　分析測試中心大型儀器設備主要分為光譜類、微區分析和表征類、核分析類、質譜中心和高性能科學計算中心這幾部分。該測試中心主要服務于教學科研工作，打造學校實驗的公共平臺。

　　質譜中心和高性能科學計算中心成立于2007年10月份，現掛靠于北師大分析測試中心。質譜中心的管理運行模式是各院系之間分散放置、統一管理。目前質譜中心有包括氣相色譜-質譜儀、液相色譜-質譜儀、同位素質譜儀等7臺質譜，今年計劃再添置4臺。

　　質譜中心是新醫藥學科建設的重要研究平臺之一，現代質譜技術在中藥品質性效用的研究、現代中藥創制的各個環節發揮著不可替代的作用。北師大質譜中心主要開展的工作重點包括：中藥活性組分的定性定量分析、藥物代謝機理及代謝動力學的研究、蛋白質及生物大分子鑒定以及代謝組學研究;還涉及質量控制與質量標準研究、藥效學評價、藥物于生物大分子相互作用等領域的研究工作。

 

　　《簽字筆墨水燃料降解機理的研究》

　　在質譜應用經驗方面，由分析測試中心王晉老師向大家介紹了課題較新穎的《簽字筆墨水燃料降解機理的研究》報告。

　　北京師范大學分析測試中心 王晉老師

　　2002年11月18日，某城市一起經濟糾紛案中被告的一張借款收據，收據的落款時間為1999年12月9日，原告提出真正的落款時間為1999年 2月9日。“12”還是“2”孰真孰假?問題的焦點就在這個“1”是什么時候寫上去的?最后法醫人員借助了HPLC的力量，分析出“1”是后添加上去的，因此判原告勝訴。

　　王晉老師從真實案例入手，道出了筆跡書寫時間鑒定的意義。

　　他們的課題組從2005年開始，長期收集簽字筆的自然老化樣本，并建立了一套方法，

　　用HPLC和LC/MS來進行筆跡老化規律及染料降解機理的研究。目前在國際上，該課題組的研究都處于領先地位。發表的相關文獻為：

• 　　Studies on the degradation of blue gel pen dyes by ion-pairing high performance liquid chromatography and electrospray tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography, A (2006), 1125(1), 95-103.
• 　　Classification and dating of black gel pen ink by ion-pairing high-performance liquid chromatography. Journal of Chromatography, A (2006), 1135(1), 57-64.

　　王晉老師的工作是：選擇20支具有代表性的黑色簽字筆，從2005年1月31日至今長期收集這20支簽字筆的自然老化樣本，浸泡提取后應用HPLC方法和LC/MS方法進行筆跡老化規律及染料降解機理的研究。

　　研究路線如圖所示。

　　研究路線圖示

　　在HPLC筆跡老化規律研究方面

　　HPLC流動相選擇了四丁基溴化胺作為離子對試劑，可以使墨水中的染料組分有效分離。在此基礎上，根據色譜峰數目、保留時間等因素將簽字筆墨水分為八類。研究各類簽字筆筆跡在自然老化條件下的染料組分變化規律，以及與字跡形成時間的關系。老化實驗研究結果表明，不同類別的簽字筆墨水組分隨老化時間都發生了明顯變化，呈現出各自特征的變化規律。部分簽字筆墨水在自然老化條件下染料組分迅速分解產生新的組分，新組分的相對含量隨老化時間延長而迅速增加。從實驗結果可以看出，樣品經長期自然放置后，隨老化時間發生明顯變化，且變化方向有規可循;可依次建立研究方法，為推斷簽字筆字跡的形成時間提供科學依據。

 

　　在LC/MS染料降解機理方面

　　根據各墨水組分自然老化結果，選擇不同老化規律的三類簽字筆墨水，分析其染料成分發現：第一類墨水I24中含有染料Direct Yellow 7;第二類墨水I22中含有染料Acid Violet 49和Acid Blue 9;第三類墨水I29中含有染料Acid Red 52和Diret Black 19。在染料降解機理探討過程中發現：第一類墨水中的Direct Yellow 7變化較為明顯，在自然老化條件下就能發生明顯的降解過程;第二類墨水中的Acid Violet 49結構較為穩定，不易在自然放置過程中發生變化，但經光老化后卻能生成較多的降解產物，且在日光燈老化條件下降解程度比在紫外燈老化條件下更為明顯;第三類墨水中的Acid Red 52在自然和人工老化過程中都能發生降解，生成新組分，但人工老化降解趨勢和程度都更為顯著;而Direct Black 19在人工老化過程中并未發生組分含量變化，也未能發現新組分的生成，說明其結構十分穩定，并不隨老化條件而發生變化。王晉老師重點介紹了第三類墨水的研究過程。

　　該研究為簽字筆字跡形成時間的判定提供了有力的科學依據，為墨水染料降解機理的研究建立了可行的實驗方法。該課題組長期積累的大量樣本和數據，以及持續不懈的研究，將為“筆跡時間鑒定”這類涉及案例眾多、難判的“官司”提供愈來愈多、愈來愈可靠的科學證據。

　　報告后的提問中，在座專家詢問利用光譜技術如紅外光譜是否能夠進行上述的檢測，謝孟峽教授指出紅外光譜的靈敏度不夠高，另外沒有經過色譜分離，抗干擾能力和分析特異性都不及液相色譜和質譜。

　　本網收錄前沿Lab：北京師范大學分析測試中心

 

　　用電噴霧質譜研究四鏈體DNA的形成、穩定性及其構象

　　來自北京大學化學學院分析測試中心的周江博士，為大家做了題為《用電噴霧質譜研究四鏈體DNA的形成、穩定性及其構象》的報告。

　　北京大學化學學院分析測試中心 周江博士

　　富G序列存在于許多重要的DNA片段中，特別是端粒DNA中。端粒是染色體末端一類特殊的結構，它是由富含鳥嘌呤的重復序列構成。人類端粒DNA含有大量TTAGGG重復單元，除了其2-10kb的雙鏈部分外，還有約200b的單鏈部分。近年來發現，這部分單鏈富G序列可以在陽離子(如K⁺、Na⁺等)的存在下自我纏繞折疊形成G-四鏈體的結構，G-四鏈體是由G-四分體堆積形成的，每個G-四分體則是由一個平面上的四個鳥嘌呤所構成，每個鳥嘌呤都同時作為堿基對氫鍵的給體和受體。由于這種四鏈體的結構極有可能影響某些功能蛋白(如端粒酶)的結合位點，考慮到端粒對DNA結構的穩定作用及抗癌性，所以研究人體端粒DNA四鏈體的形成、性質及小分子結合性對于抗腫瘤藥物的設計有著深刻的意義。

　　G-四鏈體結構圖

　　質譜儀器采用Thermo公司的Finnigan LCQ Deca XP plus，離子傳輸管溫度設為100°C，噴霧電壓為2kV，Sheeth Gas設為20arb，采用2 μL/min的直接電噴霧方式。

 

　　第一部分，本研究首先用電噴霧質譜法研究了6堿基XGGGGX四鏈體DNA的形成規律，發表于Chem. Eur. J. 2007, 945-949上：

　　選擇的靶點為一種原生動物的端粒序列，其重復序列為TGGGGT標記為Q(1)，選擇相似A、C作為不同的末端分別標記為Q(2)和Q(3)，四鏈體結構中間配有一定的陽離子(NH4⁺，用NH4⁺是因為對質譜比較友好)輔助配位，單鏈的富G序列可以在陽離子的存在下自我纏繞折疊形成G-四鏈體的結構。可能與該四鏈體結構相互作用的分子選擇了一個寡聚酰胺分子ImImImβDp和一平面分子Tel01。

　　1、在加入NH4⁺離子的情況下，15個含6nt寡聚核苷酸，只有XGGGGX才能夠形成四聚體峰，并且穩定性為Q(2) > Q(1) > Q(3)，這與分子模擬計算的結果一致。

　　2、對于XGnX的序列，可以得到“n-1規則”：四聚體中心NH4⁺離子的個數總是G-平面的個數減1。

　　3、小分子與Q(1)的結合強弱順序為：Tel01 >> ImImImβDp。Tel01相對寡聚酰胺分子有著更強的結合。對于Q(2)和Q(3)序列，得到了類似的親和性大小關系。

　　4、改變質譜的溫度條件，可以得到四聚體解鏈的溫度。小分子與四聚體結合后，起到了穩定化的作用，并且結合越強，解鏈溫度越高。且對于同一個小分子，幾個四聚體的穩定性順序為Q(2) > Q(1) > Q(3)。

 

　　第二部分，用電噴霧質譜研究了人類端粒DNA四鏈體，發表于Chem. Eur. J. 2007, 5018-5023：

　　選擇人類的端粒作為目標DNA，其重復序列為TTAGGG，選擇兩個重復的TTAGGG及其互補鏈即TTAGGGGTTAGGG/CCCTAACCCTAA形成的雙鏈結構標記為D,選擇四個重復的AGGGTT序列形成的四鏈體結構標記為Q。選擇ImImImβDp(標記為III)、PyPyPyγImImImβDp(標記為T6Y)和Tel01作為其結合分子。

　　1、人類端粒四聚體DNA與小分子的結合親和力順序是：Tel01 > ImImImβDp >> PyPyPyγImImImβDp。這與小分子本身的結構及結合模式有關系。

　　2、在模擬人體內同時存在雙鏈與四聚體DNA的情況下，本研究發現：小分子ImImImβDp對二者沒有特殊的選擇性，PyPyPyγImImImβDp對雙鏈DNA有特異的選擇性，而平面分子Tel01對于四聚體DNA有特異的選擇性，這種選擇的特異性對今后在研究藥物尋找靶點的方向上有很大的幫助。這是首次在同一個體系中檢測到小分子與多個DNA的特異選擇性結合。

　　3、人類端粒DNA在純水中，(AGGGTT)4序列的構象主要是以單鏈為主，加合峰、電荷較多;加入Tel01分子后，構象以收斂的四聚體為主，電荷、加合峰較少。CD的結果驗證了這個結論，且平面分子Tel01使得(AGGGTT)4序列轉化為反向平行的四聚體結構，說明反向平行構象更利于與Tel01結合。

　　4、退火(把雙鏈DNA加熱至90°C 保持10min，慢慢冷卻至室溫)對于這種長鏈形成的四聚體DNA與Tel01的結合有著很大的影響，退火前在NH4Ac中，Tel01與(AGGGTT)4序列有很強的結合，而退火之后結合峰變弱。CD結果同樣顯示，在NH4⁺離子存在下，退火前構象為反向平行，退火后為正向平行，而Tel01分子更易與反向平行構象結合，所以退火前的構象更有利于與平面分子Tel01結合。

　　5、在純水中引入NH4⁺和K⁺離子后，質譜和CD的結果都表明四聚體結構大大增加，說明中心陽離子對于穩定和維持四聚體結構具有重要的作用。

　　本網收錄前沿Lab：北京大學分析測試中心

　　報告下載：《用電噴霧質譜研究四鏈體DNA的形成、穩定性及其構象》

 

　　LC-MS/MS高通量定量分析的平臺——DiscoveryQuant^TM軟件

　　最后由自來AB公司的張克榮工程師向大家介紹的報告為《LC-MS/MS高通量定量分析的平臺——DiscoveryQuant^TM軟件》。

　　AB公司 張克榮工程師

　　AB公司推出的DiscoveryQuant^TM軟件主要為藥物開發工作提供了一個高通量定量分析的平臺。藥物開發一般分為藥物發現、臨床前實驗、藥物發展及生產制造這四個階段，在藥物開發階段的定量和定性分析上都有嚴格的法規要求貫穿始終。近年來國家對仿制藥管理越加嚴格，促使國內大量藥廠也積極投入到藥物發現階段。該階段需要在大量的化合物中進行篩選、工作量很大，而DiscoveryQuant^TM軟件為該階段工作提供了一個快速篩選的平臺。

　　早期藥物發現階段工作的兩個關鍵問題首先是優化分析方法，找到最理想的LC/MS/MS方法;其次則是對篩選出的藥物進行大批量的測定工作。

　　AB公司在2007年首次將DiscoveryQuant^TM軟件提供給用戶使用，該軟件最初是同輝瑞制藥的合作研究成果，目前已普遍應用于全球的大型藥廠。

　　DiscoveryQuant^TM軟件分為方法優化和樣品分析兩個分析步驟。方法優化可以快速調機和靈活查看結果，每天可完成100個化合物以上的方法優化;樣品分析可將優化的方法快速移植到大批量分析，從而完成早期藥物發現階段的高通量篩查。

 

　　分析方法的優化

　　該軟件的工作流程首先選擇實驗類型，在方法建立初期首先進行Q1掃描來找到化合物的分子離子峰，在該過程中可對該化合物進行DP(Declustering Potential)優化，優化后給予能量并打碎，一般串聯質譜定量分析采用MRM的方法，第一步對其母離子進行全掃描，在該化合物合適的情況下再進行二級MS/MS分析，之后對其能量進行優化，優化結果將放到數據庫里，最終實現全自動、高通量的智力工作流程。

　　優化之后滿足條件的化合物存儲到數據庫里，該數據庫可以全球共享，使用于多個實驗室之間。數據來源可從當地數據庫或全球數據庫里進行選擇，只須提供化合物的分子量該軟件就會自動進行優化，在優化的過程中可以定義一些強度、質量數的預知，在尋找母離子時可提供偏差數據從而縮小操作范圍。在條件設定的過程中，可設定優化對Q1掃描相關的質譜參數進行掃描。在優化過程中可以隨時使用暫停鍵審查Q1全掃描數據質量，然后再開始子離子掃描。

　　優化結果面板將會顯示符合條件的化合物數量，優化出的最佳條件，優化后的DP參數和CE參數。

　　張克榮工程師指出經過反復實驗驗證，人工優化與DiscoveryQuant^TM軟件優化結果是相同的。該數據庫存貯了每一個化合物的優化方法，對以后進行滲透性、傳輸性、穩定性的研究提供了有效地信息。

 

　　樣品的分析測定

　　在樣品分析步驟中，該軟件可對幾個或幾十個化合物同時進行分析，對優化后的化合物該軟件利用cassette功能，通過設定一些限定條件便可將這些化合物進行分組，可自動生成樣品列表。由于化合物數量大，該軟件也可根據實驗日期、內容設定樣品的名稱，以便利于分析查看。

 

　　DiscoveryQuant^TM軟件特色

• 　　支持更多的自動進樣器型號(Shimadzu，Agilent，Acquity);
• 　　兼容所有Analyst軟件可控的液相泵;
• 　　可選擇建立全球數據庫;
• 　　通過cassette可自動對分析化合物進行分組;
• 　　樣品、批文件和數據文件的智能化命名;
• 　　方便的文件建立工具——可視化的樣品盤設定;
• 　　兼容多種LIMS系統，便于實驗室數據管理;
• 　　配有動畫實例向導，形象直觀的操作流程介紹。

　　會議結束后，大家分別參觀了高性能科學計算中心、核磁共振室、質譜室等。

　　高性能計算機中心

　　氣質聯用儀

　　500兆超導核磁譜儀