質譜研究蛋白質相互作用（一）

　　質譜技術已經成為了蛋白質組學研究的主力。這種技術方法能精確的檢測多肽，從而幫助研究人員識別并測序多肽分子，分析它們的特征，了解它們如何進行化學修飾的。

　　但大多數蛋白質并不是單獨行動的，一些關鍵的生物學過程，如DNA 復制、轉錄、翻譯、細胞分裂和能量生成都依賴于大型蛋白復合物的行為，這些蛋白復合物常常涉及幾十個亞基，十分復雜，傳統的質譜方法難以進行研究。

　　來自西北大學蛋白質組研究中心的設備主任Philip Compton表示，確實，蛋白復合物難以進行研究，許多類型的分析都用不上。大多數復合物都由非共價作用連接在一起，瞬間組合，或者定位在細胞膜上，因此為樣品準備增加了難度。而且雖然一些復合物相對來說富集，但是還是有一些數量很少，這也進一步阻礙了檢測和分析。

　　從質譜技術的角度來說，分析質量大約為500kDa的蛋白復合物，問題在于大小，“對于質譜技術，這么大的尺寸傳統技術很難分析，”Compton說。即使你能將它們弄進質譜儀中，也需要一種計算方法來分析存在的蛋白，此外正常的樣品準備過程也會令蛋白變性，破壞蛋白復合物。

　　為此研究人員不斷改進質譜技術，希望能通過技術改進來解決這個問題：

　　確定亞基組成

　　研究員：西北大學蛋白質組研究中心的設備主任Philip Compton

　　項目：高通量top-down 蛋白質組學

　　解決方案: 如果說蛋白復合物是洋蔥的話，那么Compton就采用了一種逐層剝離的進行研究。他與Thermo Fisher公司的研究人員合作，研發出了一種基于 Orbitrap 的質譜儀，完成后被稱之為MS3的系統。

　　Orbitrap 脫胎于由通用電氣公司的K. Kingdon于1923年發明的一個稱為Kingdon trap的離子捕集裝置。經過多年的發展，成為了一種全新的質量分析器。Thermo Fisher也基于此發展出了多種質譜儀，在各個領域發揮著重要的作用。

　　Compton進行的這種基于Orbitrap 的MS3研究主要就是分析樣品中所有復合物，每次大約分析10-15種——通過捕獲，放進一個惰性其它分子裝置中碾碎，彈碰一個亞基，然后進行稱重，測序，再然后就是復核。

　　由于這一設備還未完全構建成，因此Compton將這些稱為“偽-MS3”實驗。從本質上來說，這一設備就是分離了蛋白復合物，對碎片進行分析，并重復這一過程（Anal Chem, 85:11163-73, 2013），“我們將這個技術實驗拆分成兩步，但實際上都是做的同樣的事情，”Compton說。

　　Compton和他的團隊已經開始將這用于參與代謝的蛋白復合物研究中。比如乳酸脫氫酶 (LDH) ，一種由兩個M (muscle) 和 H (heart) 亞基組成的145 kDa蛋白復合物，它可以有五種構成：MMMM，MMMH，MMHH，MHHH和HHHH。

　　利用MS3系統，Compton說他可以分辨出不同的蛋白組成，以及亞基可能出現的翻譯后修飾，并確定每種修飾的豐度。目前他希望可以利用這種方法定量分析不同細胞和組織類型中LDH的差異。

　　設備裝置：Compton研究組采用的是Thermo Fisher的 Orbitrap-based Q Exactive HF mass spectrometer，這是一種組合型四極桿 Orbitrap 質譜儀，威力巨大。你也可以選擇其它相似的系統，如 Exactive Plus EMR Orbitrap system，不過由于EMR缺少Compton定制硬件的“高質分離能力”，因此應用范圍可能會受限。他表示，“如果你的復合物相對來說比較純，那么可以進行這樣類似的實驗。”