超高分辨直接觀測基因表達的染色質時空調控

　　生命科學的一個基本問題是在個體發育中，單個細胞如何分化成各種類型的組織細胞。這個過程高度依賴于基因表達的精確時空調控，而這種細胞特異基因表達與染色質的調控密切相關。比如，不同的順式調控原件增強子能夠在不同細胞中選擇性地激活目標基因。每個基因經常由分布在千堿基(kb)甚至兆堿基(Mb)以外的多個增強子來調節，而增強子能夠選擇性地激活靶基因常常歸因于基因組的三維空間結構。因此，在納米尺度、千堿基分辨率條件下研究染色質的三維結構對解析胚胎發育過程中細胞分化與細胞命運決定至關重要。

　　基于高通量測序的染色質構象捕獲技術（3C和Hi-C）已經鑒定出大量的組織特異染色質環（loops），并發現了胚胎發育不同時期的特異染色質拓撲結構域（TADs）。但是這些研究主要是群體細胞分析的結果，并不能知道單細胞行為是否有所不同。單細胞Hi-C方法雖然揭示了染色質結構的異質性，但其分辨率不足以在單細胞水平看到清晰的TAD結構。2018年11月份，哈佛大學莊小威實驗室和其博后Alistair Boettiger（現任職于斯坦福大學的助理教授）在Science上發表論文，利用她們早期建立的MERFISH技術，結合超高分辨顯微成像技術解析了30 kb分辨率下的單細胞TAD結構【1】。利用這個方法直接證明了類TAD結構域是在細胞里真實存在的物理性結構，同時也發現類TAD結構以及其邊界（boundaries）在單細胞中的高度異質性。但是30 kb的分辨率并不足以看到基因內部的精細結構，比如組織特異的增強子與啟動子相互作用等。（專家解讀丨莊小威組在Science總結超分辨顯微成像技術）

　　2019年3月19日，Alistair Boettiger實驗室又在Nature以長文發表題為Visualizing DNA folding and RNAin embryos at single-cell resolution的論文，把染色質DNA檢測的分辨率提高到2 kb，能清晰得看到增強子與啟動子相互作用，并且同時檢測新生RNA（nascent RNA）水平來研究增強子與啟動子相互作用對基因轉錄的影響【2】。利用該方法，這項工作做到了在胚胎中上千個細胞中同時原位檢測染色質三維結構和基因表達。這項令人激動的成果展示了如何高精度直接觀測基因表達的染色質時空調控。

　　首先Alistair Boettiger實驗室開發并命名一項名為ORCA（Optical Reconstructionof Chromatin Architecture)的新技術, 暫且翻譯為染色質結構的光學重建技術（圖1）。其原理和去年莊小威實驗室與Alistair Boettiger實驗室一起發表在Science論文中的技術并無差異，主要是把MERFISH與STORM技術有機結合（詳見：專家解讀Science | 莊小威實驗室揭示單細胞染色質超分辨顯微結構）。但ORCA技術通過優化條件提高了基因組分辨率到2 kb、同時檢測了mRNA和新生RNA、并且應用于果蠅胚胎。

圖1. ORCA染色質結構的光學重建技術

　　本文的研究主要集中在bithorax complex(BX-C)區域（圖2）, BX-C屬于Hox基因家族成員，該區域由Ubx、Abd-A、Abd-B三個基因組成,跨越330kb。這三個基因通過各自的增強子精細調控它們組織特異的表達，每個基因的表達異常都會導致發育缺陷甚至致死。所以進一步研究這個區域的染色質三維結構、組織特異的增強子與啟動子相互作用至關重要。

圖2. bithorax complex(BX-C)區域

　　研究者首先通過結合smFISH標記RNA和OCRA標記基因組DNA，在同一個果蠅胚胎中檢測了18種mRNA（圖3a），11種新生RNA（圖3b）以及OCRA方法檢測了330 kb BX-C區域基因組DNA（圖3c）；這些方法可以使我們清楚地觀察到各個基因在果蠅胚胎中組織的特異表達以及在各個組織中對應的染色體三維結構。

圖3. 果蠅胚胎中檢測mNRA、新生RNA和OCRA包含BX-C的330 kb基因組DNA

　　為了進一步研究BC-X在組織特異表達的調控機制，研究者首先把果蠅胚胎分成了Head,T1-T3,A1-A9等13段（segments）（圖4a），圖中可以清楚的看到Head與T3的BX-C的染色質三維結構是完全不同的（圖4b）。

圖4. 果蠅胚胎分段以及對應的BX-C染色質三維結構

　　以前的實驗表明，組蛋白H3K27me3的表觀修飾對BX-C中的三個基因Ubx、Abd-A、Abd-B的表達起到決定性作用。H3K27me3修飾的區域獨立形成一個結構域（TAD），并與沒有H3K27me3的修飾區域形成明顯的邊界（Boundaries）,其中具有H3K27me3修飾的結構域里面的基因將被沉默（圖5，左列）。OCRA技術也可以很好地檢測到類似的結構域邊界（Boundaries），而且還可以檢測到額外的結構域邊界。這些新邊界的位置與激活的增強子重疊（圖5，右列）。

圖5. OCRA揭示胚胎組織特異的結構域

　　為了證實染色質結構域（TADs）及其邊界（Boundaries）在調節胚胎發育過程中對組織特異基因表達的重要性，研究者選擇了Fub缺失突變株(△Fub)做進一步研究。△Fub缺失了4 kb，正好包含了A1段（segment）的邊界(圖5e)。△Fub果蠅的表型也是A1段形態異常，鑒定發現是由于A1段Abd-A表達異常所致。作者用OCRA證實了A1段的邊界消失（圖6a），BX-C區域染色質三維結構異常（圖6b）以及Abd-A表達異常（圖6c）。

圖6. OCRA揭示TAD邊界的突變對染色質結構域以及基因表達的影響

　　OCRA染色質結構的光學重建技術可以在納米尺度，千堿基分辨率下解析胚胎組織特異的染色質結構域內部的精細調控。利用這一個方法詳細解析了果蠅基因組中BX-C區域是如何通過染色質結構的變化來選擇性的激活或沉默基因表達，使得胚胎正常發育。OCRA技術的另一個優勢是可以在同一單細胞中同時檢測染色質三維結構與RNA水平，為研究基因在細胞分化、胚胎發育和疾病發生過程中的作用機制打開一扇新的大門。

　　以高通量測序為基礎Hi-C能夠構建染色質相互作用圖譜（contact map），但其缺點是非直接觀測，另外在同一個單細胞里構建染色質三維結構與檢測RNA水平也還相當挑戰。而以高通量成像為基礎OCRA技術可以通過直接觀測構建染色質空間圖譜（spatial map），并且可以同時提供染色質調控和基因表達水平，但目前的一個缺點是通量目前還比較低，要像Hi-C一樣把它應用于全基因組中還比較困難；基因組的覆蓋范圍有望未來隨著實驗成本的降低進一步提高。總體來說，這兩類技術在研究基因組三維結構中將會是很好的互補。同時這兩類技術還可以和活細胞跟蹤等技術相結合，在空間和時間維度上進一步闡述基因組結構域的形成、保持和動態變化，以及與基因表達的關系。

　　注：據悉，該篇解讀文章是馬涵慧和頡偉二位老師從中國前往加拿大開會（會議主題與本文直接相關）的旅途中完成，特別感謝！馬涵慧博士為上海科技大學生命科學與技術學院的助理教授、研究員，近幾年來一直從事表觀遺傳學與三維基因組的工作，連續開發了CRISPRainbow、CRISPR-Sirius等基因組活細胞成像技術跟蹤染色質在細胞不同時期的動態變化，以通訊作者身份在Nature Biotechnology、NatureMethods、PNAS等雜志上發表相關論文（Nature Methods丨馬涵慧組等開發出高靈敏CRISPR-Sirius染色體活細胞成像方法）。

　　參考文獻

　　1. BintuB, Mateo LJ, Su JH, Sinnott-Armstrong NA, Parker M, Kinrot S, Yamaya S,Boettiger NA & Zhuang X. (2018) Super-resolution chromatin tracing revealsdomains and cooperative interactions in single cells. Science 362,419.

　　2. Mateo1LJ, Murphy SE, Hafner A, Cinquini IS, Walker CA & Boettiger AN.(2019) VisualizingDNA folding and RNA in embryos at single-cell resolution. Nature.