連發4篇頂刊——顏寧團隊系統介紹鈣離子通道蛋白調控機制

　　作為從心肌的肌漿網（內質網）釋放Ca2 +的開關，2型ryanodine受體（RyR2）受到多種調節劑的復雜調節。RyR2介導的Ca2 +釋放失調與威脅生命的心律不齊有關。關鍵調節劑，例如Ca2 +，FKBP12.6，ATP和咖啡因對RyR2的調節機制仍不清楚。

　　2019年12月2日，顏寧團隊在PNAS 在線發表題為“Molecular basis for allosteric regulation of the type 2 ryanodine receptor channel gating by key modulators”的研究論文，該研究報告了豬RyR2的4種冷凍電子顯微鏡（cryo-EM）結構，這些結構與不同的調節劑結合在一起，再加上之前發表的結構，提供了對RyR2調控的機械觀察。

　　單獨的Ca2 +引起中央結構域的收縮，這有利于S6束的擴張，但不足以打開孔。 小分子激動劑PCB95幫助Ca2 +克服了打開的障礙。FKBP12.6引起中央結構域的松弛，從而使中央結構域與S6束分離，即使存在Ca2 +和PCB95的情況下，RyR2也可以在封閉狀態下穩定。盡管當用咖啡因和5'-三磷酸腺苷（ATP）代替PCB95時通道是開放的，但單獨的調節劑都不能充分對抗拮抗作用以打開通道。這項研究為這些調節劑對RyR2通道門控的遠距離變構調節提供了重要的見識，并為重要機制的機理提供了重要的框架，以了解這一關鍵參與者在心肌的興奮-收縮耦合中的調節作用。

　　另外，2019年11月25日，顏寧團隊在Nature在線發表題為“Cryo-EM structures of apo and antagonist-bound human Cav3.1”的研究論文，該研究報告了單獨的人類Cav3.1的冷凍電鏡結構以及與高度Cav3選擇性阻滯劑Z944結合的冷凍EM結構，其分辨率分別為3.3?和3.1?。弓形的Z944分子在孔結構域的中心腔中傾斜，寬端插入重復序列II和III之間的界面的窗孔中，窄端像塞子一樣懸在細胞內門上方。這些結構為比較研究不同Cav亞家族之間不同的通道特性提供了框架。這是西湖大學首次以第一單位在其發表成果。

　　2019年7月5日，原清華大學顏寧（清華大學第一單位）等人Nature 在線發表題為“Modulation of cardiac ryanodine receptor 2 by calmodulin”的研究論文，該研究報道了RyR2的8個冷凍電子顯微鏡（cryo-EM）結構，它們共同揭示了不同形式CaM的分子識別特征，并提供了對CaM對RyR2通道門控的調節的見解。Apo-CaM和Ca2 + -CaM結合由手柄，螺旋和中心區域形成的細長裂縫中的不同但重疊的位點。RyR2上CaM結合位點的轉變受Ca2 +與CaM結合而不是RyR2的控制。Ca2 + -CaM誘導各個中心結構域的旋轉和域內移位，導致PCB95和Ca2 +激活的通道的孔閉合。相比之下，ATP，咖啡因和Ca2 +激活通道的孔在Ca2 + -CaM存在下保持開放，這表明Ca2 + -CaM是RyR2門控的許多競爭調節劑之一；

　　2019年5月30日，顏寧（清華大學為第一通訊單位）及吳建平共同通訊在Cell 在線發表題為“Molecular Basis for Ligand Modulation of a Mammalian Voltage-Gated Ca2+ Channel”的研究論文，該研究報告了Cav1.1與拮抗藥物硝苯地平，地爾硫卓和維拉帕米的復合物的冷凍電子顯微鏡（cryo-EM）結構，分辨率分別為2.9?，3.0?和2.7?；Cav1.1與DHP激動劑Bay K 8644復合物的冷凍電子顯微鏡（cryo-EM）結構，分辨率為2.8?。地爾硫卓和維拉帕米穿過孔域的中心腔，直接阻斷離子滲透。盡管硝苯地平和Bay K 8644在重復III和IV的界面處占據相同的位點，但協調細節支持以前的功能觀察。這些結構闡明了不同Cav配體的作用模式，并為結構引導的藥物發現建立了框架。總之，結構研究闡明了三種臨床應用的拮抗劑和原型激動劑在原子水平上識別和調節L型Cav通道的分子基礎，并為大量實驗和臨床數據提供結構解釋。這些結構為未來針對Cav通道病的藥物發現奠定了基礎；

　　2型ryanodine受體（RyR2）是在心肌細胞的肌質網（SR）膜中表達的鈣（Ca2 +）通道，負責在興奮-收縮偶聯（ECC）過程中將Ca2 +從肌質網（SR）釋放到細胞質中。從生理學上講，該通道的開放是響應于Ca2 +進入由L型電壓門控Ca2 +通道（Cav1.2）介導的細胞而發生的，該過程通常稱為鈣誘導的鈣釋放（CICR）。RyR2介導的Ca2 +釋放是許多生物學過程的基礎，從肌肉收縮到學習和記憶。RyR2功能異常與多種嚴重疾病的病理學有關：RyR2的150多個突變可能與兒茶酚胺能性多形性室性心動過速1型，致心律失常性右室發育異常2型和特發性心室纖維性顫動有關。

　　由于RyR2對于每個心跳都很重要，因此它會受到大量調節劑（包括離子，特別是Ca2 +和Mg2 +）的復雜調節；小分子，例如5'-三磷酸腺苷（ATP）和咖啡因；蛋白質，例如FK506結合蛋白12和12.6（FKBP12 / 12.6）和鈣調蛋白（CaM）。在ECC期間，RyR2通過CICR機制激活，而骨骼肌特異性亞型RyR1通過與Cav1.1機械偶聯而激活。盡管RyR1和RyR2都顯示出對細胞質Ca2 +濃度的雙相依賴性（即，被微摩爾水平的Ca2 +激活并被毫摩爾水平的Ca2 +抑制），但RyR2被細胞質Ca2 +激活的程度更大，需要更高的[Ca2 +]進行抑制，表明這2個RyR同工型之間的重要區別在于它們對Ca2 +的激活和抑制。

　　FKBP12.6是最突出的RyR2結合蛋白之一。盡管已經廣泛研究了FKBP12.6對RyR2的作用，但FKBP12.6在調節通道中的確切作用仍存在爭議。有報道指出，FKB12.6將RyR2穩定在封閉狀態，以防止SR Ca2 +泄漏到細胞質中，而FKBP12.6與RyR2的解離導致SR Ca2 +泄漏，最終損害了收縮力并促進了心律不齊。但是，其他研究小組也報告了相互矛盾的發現，這引發了一個問題，即FKBP12.6是否在心力衰竭中發揮病理生理作用。一項研究表明，FKBP12.6和FKBP12均不影響RyR2功能；另一項研究表明，FKBP12可以激活RyR2，而FKBP12.6可以作為FKBP12的拮抗劑而不會直接降低RyR2的開放概率。因此，FKBP12.6在RyR2調節中的病理生理作用需要進一步研究。

　　單通道研究報告說，單獨的胞質Ca2 +是RyRs的弱激活劑，在沒有其他激活配體的情況下，Po不會增加到0.5以上。微摩爾胞質Ca2 +加上第二個配體的存在是通道完全活化所必需的。ATP是一種眾所周知的生理激動劑，可能與RyR2組成性結合，因為心臟細胞中的細胞ATP濃度處于毫摩爾水平。咖啡因長期以來一直用作研究RyR介導的Ca2 +釋放和心律失常的藥理探針，而2,2'，3,5'，6-五氯聯苯（PCB95）也激活RyRs。

　　在沒有FKBP12.6的PCB95 / Ca2 +（表示為P / Ca2 +）和在具有FKBP12.6的ATP /咖啡因/ Ca2 +（表示為F）下已捕獲處于開放狀態的RyR2的結構。但是，每個單獨的調節劑對RyR2門控的調節需要通過比較結構研究進一步剖析。

　　為了解決這些問題，研究人員特此報告豬RyR2與不同的調節劑結合的4種冷凍電子顯微鏡（cryo-EM）結構，這些結構與先前已發表的結構一起，為這些關鍵調節劑對RyR2通道門控的長程變構調節提供了重要的見識。

　　具體而言，單獨的Ca2 +引起中央結構域的收縮，這有利于S6束的擴張，但不足以打開孔。 小分子激動劑PCB95幫助Ca2 +克服了打開的障礙。FKBP12.6引起中央結構域的松弛，從而使中央結構域與S6束分離，即使存在Ca2 +和PCB95的情況下，RyR2也可以在封閉狀態下穩定。 盡管當用咖啡因和5'-三磷酸腺苷（ATP）代替PCB95時通道是開放的，但單獨的調節劑都不能充分對抗拮抗作用以打開通道。這項研究為這些調節劑對RyR2通道門控的遠距離變構調節提供了重要的見識，并為重要機制的機理提供了重要的框架，以了解這一關鍵參與者在心肌的興奮-收縮耦合中的調節作用。