是目前將外源基因導入細胞的最有效的方法。此系統包括重組逆轉錄病毒載體和包裝細胞兩個部分，廣泛應用的逆病毒載體LNL6是以Moloney鼠白血病病毒（MO-MLV）改建的。該病毒為RNA病毒，感染細胞后，其基因組RNA經逆轉產生雙鏈DNA拷貝插入宿主染色體形成前病毒，前病毒轉錄產生正鏈即為病毒基因組RNA。整個基因組從5′端到3′端依次是：5′長末端重復順序（LTR）編碼病毒內部結構蛋白的gag基因，編碼蛋白的pol基因，編碼外殼蛋白的env基因以及3′LTR和一個介子5′LTR和gag基因之間的包裝信號。將病毒蛋白編碼區gag、pol、env全部切除，代之以外源性目的基因即改建為病毒載體，保留了LTR和包裝信號，是一種復制缺陷性病毒。
同時，設計一種包裝細胞系，其內含有輔助病毒基因組，即為包裝信號缺乏的MO-MLV。當逆轉錄病毒載體進入包裝細胞系時，載體基因就被包裝形成完整的病毒顆粒，于是包裝細胞系就成了制造病毒載體的生產細胞系。
將靶細胞與生產細胞系其同培養或是收集含有載體病毒的生產細胞系上清液與靶細胞一起孵育，即可有效地進行基因轉移。逆轉錄病毒載體技術的優點在于轉染譜廣，可感染包括人體在內的多種動物細胞類型，一次可感染大量細胞，轉染率高達100%，轉染的基因可為單拷貝和少數拷貝，能準確地整合到宿主細胞基因組中，整合率高，且能長期有效地表達。