酵母菌的鑒定

實驗概要

了解鑒別酵母菌的實驗方法。

鑒定酵母菌的分類。酵母菌的分類依據是根據它的形態特征、生理生化反應特征來確定的。在分類前將菌體細胞進行分離純化，得到由單細胞長成的菌落，然后再進行形態特征和生理生化鑒定。

實驗原理

微生物學的類別分門、綱、目、科、屬、種，生產酒精用酵母菌屬于微生物中的真菌門、子囊菌綱、原子囊菌亞綱、內孢霉目、內孢霉科、啤酒酵母屬、卡爾斯伯酵母屬等。

(一)形態特征的鑒定

把酵母菌接種到麥芽汁固體培養基上，讓它長成菌落，觀察其菌落的形態、顏色、質地、邊緣、表面等特征。把它再接種到液體麥芽汁培養基中，觀察是否能產生醭、試管或培養儀器表面壁上能否形成菌環，培養液中是否產生沉淀、混濁程度等。另外，還要取樣在顯微鏡下觀察其單細胞的形態、大小、能否形成孢子、孢子的大小以及繁殖方式等。

(二)生理生化特征的鑒定

酵母菌的生理生化特征主要表現為發酵葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖等糖類的能力。同時，還需測定利用其它碳水化合物、同化酒精、耐酒精，利用硝酸鹽還是硫酸鹽，發酵產酸、產醋、耐溫、耐酸、抗重金屬離子、抗雜菌性等的能力。

最后，根據以上得出的形態特征和生理生化特征，查閱有關資料，把具有相同特征的一類酵母菌，就可以歸屬于某一屬。

一、酵母菌糖發酵試驗

酵母菌在厭氧條件下能分解糖類，產生各種有機酸、氣體和其它產物。酵母菌種類不同對各種糖類的發酵能力各異。因此，這是鑒別酵母菌種類的一項重要依據。

酸的產生可根據培養基中溴甲酚紫（pH6.8-5.2由紫變黃）或溴麝香草酚藍（pH7.6-6.0由藍變黃）指標劑顏色的改變來確定。產氣可由發酵管氣泡的產生予以證實。

二、酵母菌碳源同化試驗

碳是酵母菌細胞的重要組成成分，約占酵母菌體重量的50%，為酵母菌生命活動提供所需的能量和組成其結構的物質。酵母菌對各種碳源的利用，因種類不同而異。這是酵母菌分類鑒定的一個重要依據。

三、酵母菌氮源同化試驗

酵母菌蛋白酶不分泌于菌體外，故酵母菌對復雜的蛋白質不能利用，酵母菌對一些較簡單的含氮化合物的利用程度也不一致。 

四、酵母菌生長曲線的測定試驗

酵母菌屬于單細胞真核型微生物，把一定數量的酵母菌接種于的液體培養基中，在適宜的溫度下培養時，它的生長過程具有一定的規律性。在其生長過程中，定時取樣測定酵母菌細胞數量，然后以酵母菌細胞數的對數作縱坐標，生長時間作橫坐標，繪制所得的曲線叫生長曲線。此生長曲線大致可劃分為四個階段：調整期、對數生長期、穩定期和衰退期。 

主要試劑

1. 酵母菌糖發酵試驗
糖發酵基礎液，1.6%溴甲酚紫或0.2%溴麝香草酚藍溶液，葡萄糖、乳糖、半乳糖和麥芽糖，啤酒酵母斜面菌種。 

2. 酵母菌碳源同化試驗 

實驗材料

1. 酵母菌糖發酵試驗
糖發酵基礎液，1.6%溴甲酚紫或0.2%溴麝香草酚藍溶液，葡萄糖、乳糖、半乳糖和麥芽糖，啤酒酵母斜面菌種。

2. 酵母菌碳源同化試驗   

無碳基礎培養基，啤酒酵母斜面菌種，0.5%的葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、麥芽糖溶液。

3. 酵母菌氮源同化試驗 
無氮基礎培養基，啤酒酵母斜面菌，0.5%的蛋白胨、硫酸銨、硝酸銨和尿素溶液。

4. 酵母菌生長曲線的測定試驗 
酵母菌增殖培養基，蘋果酒酵母斜面菌種。 

實驗步驟

一、酵母菌糖發酵試驗

1)   糖發酵基礎液配制好后，按培養液容量的1%加入糖，分裝于杜氏發酵管中（培養液的高度約為4-5厘米），再在試管內加入倒置的小玻管（約0.4×2.0－2.5厘米）一支。每種糖設三個重復管，<121℃>高壓滅菌15分鐘。

2)   將酵母分別接入上述各發酵管中，置<30℃>下培養48-72小時，另以不接種者作對照

3)   如產酸則培養液pH值下降而變黃色；如產氣，則必先產酸，并在杜氏小管頂端出現氣泡。

4)   結果記錄。以“ ”表示產酸，“<0”>表示產氣，“＋”表示產酸產氣，“－”表示無變化，“堿”表示產堿。 

二、酵母菌碳源同化試驗

生長圖譜法

1)   無碳培養基內加入2%的水洗瓊脂，融化后冷卻至45<-50℃>，到至平板。

2)   接種新鮮培養的啤酒酵母于1毫升無菌生理鹽水內，攪勻后倒入上述未凝平板內，搖勻待凝。

3)   皿底用特種蠟筆寫上被測試各種碳源的標記。

4)   用不銹鋼匙，按標記加入相應的米粒大小的碳源，并以葡萄糖作對照。

5)   <28℃>下培養24-48小時后觀察結果。

三、酵母菌氮源同化試驗  

1、液體試管法

方法同二，以被測試的氮源代替碳源，不加任何氮源作空白對照。

2、生長圖譜法

方法同二，以被測試的氮源代替碳源，不加任何氮化物作空白對照。

3、結果觀察

1）液體試管中溶液pH值的變化。

2）生長圖譜中測量形成菌落的大小，說明對各種氮源的利用情況。

四、酵母菌生長曲線的測定試驗 

1、將培養24小時左右的酵母斜面菌種，用無菌水洗下菌苔，以3000轉/分的速率離心，得菌體。將酵母菌體沉淀物再用無菌水洗2-3次后，制備酵母菌懸液（細胞數量約106左右/毫升），測數備用。

2、取上述菌懸液1毫升于盛有清亮的酵母增殖培養液的試管中，<25℃>下培養，以此為起始時間，記錄起始溶液的細胞數。并在培養1，2，4，6，8，9，10，11，12，14，16，20，22，24小時時分別取樣檢測酵母菌細胞數量。

3、酵母菌細胞數量的檢測

方法①：活菌計數法。此法是將以上定時取出的被檢樣品作一系列稀釋后，取一定量體積（在0.1-1毫升之間）的稀釋液涂布于盛有固體培養基的培養皿內，在<25℃>下培養24小時左右，計算培養皿內菌落數就可測出溶液中活菌數量。

方法②：血球計數板計數法。此法是先將以上定時取出的被檢樣品作一系列稀釋后，使菌落數約為105-106個/毫升，取一滴稀釋液滴于血球計數板內，在顯微鏡下直接計算細胞總數。

4、繪制生長曲線

 以酵母菌細胞數的對數作為縱坐標，以培養時間作為橫坐標，畫出酵母菌的生長曲線。并分析酵母菌群體的生長規律。

附表1 酵母菌分屬鑒定結果

附表2酵母種的鑒定結果記錄