釀酒酵母的生長及其DNA的制備

YAC 克隆的酵母菌落

醋酸銨 乙醇 酚 氯仿 TE Triton SDS 溶液

YPD 培養基 Sorvall SS-34 轉頭或同類產品 玻璃珠

一、材料

1. 緩沖液和溶液

醋酸銨（10 mol/L )

乙醇

酚：氯仿（1:1，V/V)

TE ( pH 8.0)

含 20 μg/ml RNase 的 TE ( pH 8.0)

Triton/SDS 溶液

2. 培養基

YPD 培養基

3. 離心機和轉頭

Sorvall SS-34 轉頭或同類產品

4. 專用設備

玻璃珠

5. 載體和酵母菌株

攜帶目的 YAC 克隆的酵母菌落

二、方法

細胞培養

1. 將一個含目的 YAC 克隆的酵母菌落接種到 10 ml YPD 培養基中，30℃ 振搖過夜。

2. 2000 g ( Sorvall SS-34 轉頭，4100 r/min) 離心 5 min 收集細胞。

3. 棄去培養基，加 1 ml 無菌水，輕輕振動，使細胞懸浮于溶液中。

4. 按步驟 2 的方法收集細胞。

5. 去除上清，將細胞重懸于 0.5 ml 無菌水，然后移入一 1.5 ml 無菌離心管中。

6. 室溫下在微量離心機中以最大轉速離心 5 s，去除上清，收集細胞。

DNA 的提取

7. 加入 0.2 ml Triton/SDS 溶液于細胞中，輕叩離心管側壁，使細胞沉淀重新懸浮。

8. 加入 0.2 ml 酚: 氯仿和 0.3 g 玻璃珠。室溫振蕩 2 min。加 0.2 ml TE ( pH 8.0)，稍加振蕩，使體系混勻。

9. 室溫下，在微量離心機中以最大轉速離心 5 min，使有機相和水相分開。將上層水相移入另一新的離心管中。小心操作，避免將兩相界面處的物質吸入。

DNA 的分離

10. 加入 1 ml 乙醇到水相中，蓋上管蓋，將小管輕輕翻轉數次，混勻。

11. 在微量離心機中以最大轉速 4℃ 離心 2~5 min, 使 DNA 形成沉淀。用巴斯德吸管吸去上清。再次進行短暫的離心（2 s ), 除去離心管底部最后殘余的乙醇。

12. 用 0.4 ml 含 RNase 的 TE ( pH 8.0 ) 溶解核酸沉淀，然后在 37℃ 溫育 5 min。

13. 加入等體積酚: 氯仿溶液抽提經 RNA 酶消化后的溶液。最好用翻轉離心管的方法混勻，不要用渦旋振蕩。室溫下，在微量離心機中以最大轉速離心 5 min, 使水相和有機相分層。將水相移入另一新離心管中。

14. 在水相中加入 80 μl 10 mol/L 醋酸銨和 1 ml 乙醇。輕輕地翻轉小管進行混勻。室溫放置 5 min。

15. 微量離心機離心 5 min 收集 DNA 沉淀。棄上淸，用 0.5 ml 70% 乙醇灌洗核酸沉淀。 以最大轉速離心 2 min, 用巴斯德吸管吸去乙醇漂洗液。再次進行短暫的離心（2 s), 吸去離心管底部最后殘余的乙醇。將 DNA 沉淀在空氣中干燥 5 min，然后用 50 μl TE (pH 8.0) 溶解。