顧偉團隊報道磷脂酸過氧化介導的鐵死亡在腫瘤抑制中的作用

　　鐵死亡（Ferroptosis）是一種鐵離子依賴的由過量脂質過氧化積累導致的細胞膜破裂的程序性細胞死亡。通過體內體外對鐵死亡機制和功能的研究發現，靶向鐵死亡是一種腫瘤精準治療的潛在方法。然而直接靶向管家基因GPX4誘導的鐵死亡會對正常組織產生不可避免地損傷：2022年11月，阿斯利康和賓夕法尼亞大學研究人員在 Nature 上發文證實經典鐵死亡誘導劑會導致腫瘤內免疫細胞，特別是中性粒細胞的鐵死亡，從而破壞腫瘤免疫從而促進腫瘤生長。因此，探索不依賴于經典鐵死亡抑制劑的體內激活鐵死亡來治療腫瘤的方法是一個亟需解決的科學問題。

　　哥倫比亞大學歐文醫學中心癌癥醫學研究所顧偉教授團隊自2015年以來在鐵死亡抑制腫瘤發生發展領域做出了一系列的工作：2015年在Nature發文揭示p53通過抑制胱氨酸轉運蛋白SLC7A11表達促進鐵死亡，建立了p53及p53乙酰化與鐵死亡新的聯系；2019年在Nature Cell Biology發文提出p53介導的鐵死亡是通過脂質加氧酶ALOX12由高ROS驅動下實現的；2021年在Nature Communications發文揭示p53轉錄調控磷脂酶iPLA2β能夠發揮獨立于GPX4的調控鐵死亡機制；2023年在Cell Metabolism發文報道p53可以通過抑制維生素K代謝促進鐵死亡從而抑制腫瘤的發生發展。

　　2024年2月2日，顧偉教授團隊（楊鑫博士為第一作者）再次在 Cell Metabolism 期刊上發表了題為：PHLDA2-mediated phosphatidic acid peroxidation triggers a distinct ferroptotic response during tumor suppression 的研究論文。

　　該研究揭示了由膜結合蛋白PHLDA2介導的一條酶催化的非經典的磷脂酸（phosphatidic acid，PA）過氧化誘導的鐵死亡通路在腫瘤抑制中發揮關鍵作用。

　　首先，研究團隊通過CRISPR-Cas9全基因組敲除篩選發現膜結合蛋白PHLDA2和經典鐵死亡誘導基因ACSL4都可以作為關鍵調控因子參與胱氨酸饑餓導致的鐵死亡。細胞內無論是PHLDA2或ACSL4的敲除均會降低胱氨酸饑餓后脂質過氧化的水平和鐵死亡。由于胱氨酸饑餓不僅會導致谷胱甘肽（GSH）水平下降從而抑制GPX4功能，還會導致活性氧（ROS）水平上調。因此，他們對細胞進行有機過氧化物處理，包括過氧化氫叔丁醇（TBH，tert-butyl hydroperoxide）或過氧化氫異丙苯（CMH，cumene hydroperoxide），來探索模擬高ROS水平的條件下細胞鐵死亡的調節。研究團隊首先證明8小時以內TBH或CMH處理導致的細胞死亡全部是鐵死亡。

　　他們進一步發現PHLDA2敲除細胞顯著抑制高水平ROS誘導的脂質過氧化的水平和細胞死亡，而ACSL4敲除不會改變細胞對高水平ROS誘導的鐵死亡的敏感度。眾所周知，ACSL4敲除會顯著降低細胞對GPX4抑制劑（例如RSL-3）導致的鐵死亡敏感度，但是PHLDA2敲除細胞對于GPX4抑制劑誘導的鐵死亡沒有影響。這些實驗說明PHLDA2是胱氨酸饑餓或高水平ROS誘導的鐵死亡中不可缺少的因子，其功能獨立于經典的ACSL4-GPX4介導的鐵死亡通路。

　　顧偉課題組前期研究證明催化多不飽和脂肪酸（PUFA）氧化的脂氧合酶ALOX12是高水平ROS誘導的鐵死亡中的關鍵因子，但是嚴格定位于細胞質內的ALOX12如何發揮促進膜上脂質過氧化的機制仍不明確。通過對純化的ALOX12結合蛋白質復合物進行質譜分析，研究團隊鑒定出PHLDA2是ALOX12的結合蛋白。通過一系列體內體外生物化學實驗和細胞鐵死亡實驗，他們證明ALOX12與PHLDA2結合對于高水平ROS誘導的鐵死亡至關重要。

　　考慮到ACSL4/GPX4通路調控的鐵死亡的機制主要是由磷脂酰乙酰胺（PE， phosphatidylethanolamine）過氧化所決定的，研究團隊進一步通過體外靶向磷脂氧化實驗探索PHLDA2 -ALOX12介導的高水平ROS誘導的鐵死亡的機制。他們首先檢測PHLDA2 與不同類型磷脂之間的結合親和力，發現PHLDA2和PA具有顯著的結合能力，且與PE不結合。盡管ALOX12本身不能夠結合任何磷脂，但在PHLDA2存在時ALOX12也能夠顯著結合PA，且不結合PE，說明PHLDA2能招募ALOX12至特定種類的磷脂。進一步通過靶向氧化磷脂組學，作者發現PHLDA2能顯著增強ALOX12催化的花生四烯酸酯化磷脂（18:0/20:4-PA）的過氧化，且抑制18:0/20:4-PE的過氧化，說明PHLDA2通過其選擇性結合磷脂的能力調控ALOX12對于磷脂的選擇性過氧化。進一步，研究團隊在ACSL4/GPX4雙敲除細胞中孵育含有18:0/20:4-PA的脂質體，此時過表達PHLDA2和ALOX12能夠顯著增強細胞鐵死亡的水平，證實PHLDA2/ALOX12復合物可以通過催化的帶有長鏈不飽和脂肪酸的PA的過氧化在沒有經典鐵死亡誘導劑的條件下啟動鐵死亡。

　　為了進一步闡明PA介導的高水平ROS誘導的鐵死亡的內在代謝調控機制，研究團隊比較了RSL-3和TBH處理的CRISPR-Cas9全基因組敲除篩選結果。他們發現GPAT3是PA合成酶中唯一一個在TBH誘導的鐵死亡起到關鍵作用的。GPAT3敲除細胞顯著抑制胱氨酸饑餓或TBH誘導的鐵死亡，而在RSL-3誘導的鐵死亡中沒有明顯作用。通過磷脂代謝組學分析，他們發現TBH處理后可以顯著降低PUFA-PA的含量且敲除GPAT3或者鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1處理可以完全挽救這個現象，證明高水平ROS誘導的鐵死亡中存在PUFA-PA的消耗。進一步通過氧化磷脂代謝組學分析，他們發現所有類型的磷脂在TBH處理后都會出現過氧化水平上升的現象，但是只有PUFA-PA的氧化會被敲除GPAT3或者鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1處理完全挽救。很有意思的是，敲除GPAT3的細胞在TBH處理下并沒有出現細胞死亡現象，但是PUFA-PE的過氧化仍然維持在很高的水平，說明PUFA-PE的過氧化在高水平ROS誘導的鐵死亡中的作用微乎其微。

　　最后，為了闡明PHLDA2介導的PA過氧化誘導的鐵死亡在體內腫瘤抑制中的作用，作者首先利用免疫缺陷的異種移植模型探索PHLDA2在腫瘤生長中的作用。和ACSL4敲除組相比，PHLDA2敲除顯著促進腫瘤的生長。通過各項鐵死亡標志物的分析，研究團隊發現與ACSL4敲除組相比，PHLDA2敲除的腫瘤中表現出明顯的鐵死亡抑制現象。他們進一步在免疫系統完整的小鼠中構建了致癌物（DEN，diethylnitrosamine）誘發的肝癌模型和Eμ-Myc誘導的淋巴瘤模型，發現PHLDA2敲除會顯著增強腫瘤的發生發展，證明PHLDA2介導的鐵死亡在腫瘤抑制中發揮關鍵的作用。

　　綜上所述，該研究證明了PHLDA2介導的鐵死亡對于機體抵抗腫瘤發生至關重要。考慮到PHLDA2介導的鐵死亡不需要經典鐵死亡誘導劑的誘導，而是在高水平ROS積累下自然發生的，這項工作將為腫瘤治療中靶向鐵死亡提供了新思路。

　　哥倫比亞大學顧偉教授為論文通訊作者，楊鑫博士為論文第一作者。該工作得到了匹茲堡大學Valerian E. Kagan教授、哥倫比亞大學Hülya Bayir教授、Brent R. Stockwell教授和張志國教授以及紀念斯隆-凱特琳癌癥中心姜學軍教授等合作者的大力支持。