不同的細菌具有各自的獨特的酶系統，因而對底物的分解能力各異，其代謝的產物也不相同。這些代謝產物又具有不同的生物化學特性，可利用生物化學的方法測定這些代謝產物以鑒定細菌。掌握各種生化反應的原理和應用是細菌鑒定的基礎。生理生化特性的測定主要根據Shirling & Gottlieb《InternationalJournal of Systematic Bacteriology》中鑒定的有關試驗。
（一）碳水化合物代謝實驗
糖（醇、苷）類發酵實驗
（1）原理：
細菌分解糖的能力與該菌是否含有分解某種糖的酶密切相關，故分解糖的能力各不相同，細菌分解糖類后的終產物亦不一致，在含糖培養基中加入指示劑，若細菌分解糖則產酸或產酸產氣，使培養基顏色改變，從而判斷細菌是否分解某種糖或其他碳水化合物
（2）基本培養基：
在培養基中加入0.5%～1%的糖類（單糖、雙糖、或者多糖）、醇類（甘露醇、肌醇）苷類（水楊苷、菊糖等）。培養基可為液體、半固體、固體或微量生化管幾種類型。
（3）實驗方法：
取某一種細菌的24h純培養物分別接種到葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖等培養基內，37℃培養24h，觀察結果并記錄。
（4）結果判定：
如果接種進去的細菌可發酵某種糖或醇，則可產酸，使培養基由紫色變成黃色，如果不發酵，則仍保持紫色。如，發酵的同時又產生氣體，則在微量發酵管頂部積有氣泡。
（5）應用：
是鑒定細菌最主要最基本的實驗，特別是對腸桿菌科細菌的鑒定尤為重要。
氧化型與發酵型(O/F)的測定
（1）原理：
細菌在分解葡萄糖的過程中，必需有氧的參加的，稱為氧化型，細菌在分解葡萄糖的過程中，可以進行無氧降解的，稱為發酵型。發酵型細菌無論在有氧或者無氧的環境中都能分解葡萄糖。不分解葡萄糖的細菌稱為產堿型。這在區別微球菌與葡萄球菌、腸桿菌科成員中尤其有意義。
（2）培養基：
培養基蛋白胨2g，氯化鈉5g，磷酸氫二鉀0.3g，葡萄糖10g，瓊脂3g，1％溴麝香草酚藍3mL，蒸餾水1000mL。將蛋白胨、鹽、瓊脂和水混合，加熱溶解，校正pH至7.2，然后加葡萄糖和指示劑，加熱溶解；分裝試管，3～4mL/管；115℃，高壓蒸汽滅菌20min，取出后冷卻成瓊脂柱。
（3）實驗方法：
挑取18～24h的幼齡斜面培養物，穿刺接種，每種細菌接種兩管，于其中1管覆蓋1mL滅菌的液體石蠟，37℃培養24小時或更長時間。
（4）結果判定。
Β-半乳糖苷(ONPG)實驗
（1）原理：
有的細菌可以產生β一半乳糖苷酶，能分解鄰－硝基酚－β－D－半乳糖苷，而生成黃色的鄰－硝基酚，在很低濃度下也可以檢測出。
（2）培養基：
鄰硝基酚β-半乳糖苷0.6g，0.01mol／L pH7.5磷酸緩沖液1000mL，pH7.5的滅菌1%蛋白胨水300mL。先將前兩種成分混合溶解，過濾除菌，在無菌條件下與1％蛋白胨水混合，分裝試管，每管2～3mL，無菌檢驗后備用。
（3）實驗方法：
取一環細菌純培養物接種在ONPG培養基上置37℃培養1～3h或24h，如有β－半乳糖苷酶，會在3h內產生黃色的鄰硝基酚；如無此酶，則在24h內不變色。
七葉苷水解實驗
（1）原理：
有的細菌可以將七葉苷分解為七葉素和葡萄糖，七葉素與培養基中的枸櫞酸鐵的二價鐵離子反應，生成黑色的化合物，使培養基呈黑色。
（2）應用：
主要用于腸球菌與其它鏈球菌的鑒別，前者陽性，后者陰性，也可用于革蘭氏陰性桿菌及厭氧菌的鑒別。
甲基紅實驗
（1）原理：
細菌分解培養基中的葡萄糖產酸，當產酸量大，使培養基的pH降至4.5以下時，加入甲基紅指示劑而變紅，為甲基紅試驗陽性。若細菌分解葡萄糖產酸量少，或產生的酸進一步轉化為其它物質（如，醇、酮、醛、氣體和水等）則培養基的pH值仍在pH6.2以上，故加入甲基紅試劑呈黃色，為陰性。
（2）實驗方法：
一種細菌的24h培養物，接種于葡萄糖蛋白胨水培養基中，置37℃培養48～72h，取出后加甲基紅試劑3～5滴，凡培養液呈紅色者為陽性，橙色者為可疑，黃色者為陰性。
（3）應用：
主要用于鑒別大腸埃希菌與產氣腸桿菌，前者為陽性后者為陰性。
V-P實驗
（1）原理：
有些細菌能分解葡萄糖產生丙酮酸, 丙酮酸脫羧產生乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇在堿性環境中，被空氣中的氧氧化為二乙酰,二乙酰與培養基內蛋白胨中精氨酸所含的胍基發生反應生成紅色的化合物。若培養基中的胍基含量過少，則可加入少量含胍基的化合物等。
（2）V-P試劑：
肌酸0.3%或原粉，40%的NaOH溶液。
（3）實驗方法：
接種實驗菌于葡萄糖蛋白胨水培養基(與甲基紅實驗相同)中，每次兩個重復，置適溫培養2-6d，取培養液和40%NaOH等量相混，加入少許肌酸，10min如培養液出現紅色，即為實驗陽性反應，有時需要放置更長時間才出現紅色反應。
（4）應用：
本實驗常與甲基紅實驗一起用，因為前者陽性的細菌，后者通常為陰性。