高內涵篩選在生命科學研究中的應用

【摘要】過去的幾十年來，成像作為一種基于細胞的檢測模式，在現有的和正在開發的生物模型中，開啟了一個測量“終點表型” 的全新世界。這些“高內涵”方法結合了多種細胞生理學的測量手段，不管它是來源于亞細胞組分、多細胞結構還是模式生物。 這樣產生的多層面的數據可以幫助人們對很多復雜現象產生新的認知，這些現象可以包括細胞分化，也可以包括化合物藥物學和 毒理學研究。我們查閱了日益增加的文獻報道，了解其主要的應用領域，已發現了充足的證據表明這項科學技術正在對藥物研發 和生命科學產生著實實在在的影響。

關鍵字：高內涵篩選；細胞信號通路；腫瘤學；神經生物學；體外毒理學；靶點鑒定；靶點驗證；RNA干擾；干細胞

簡介

高內涵篩選（High Content Screening， HCS）是自動化顯微成像技術與圖像分析技術在藥物研發及細胞生物學方面的一個應用。這個技術已經從最初的一個有趣命題發展成為一種有用的技術，并在最近十年中演變成為有價值的實用方法。這篇綜述旨在總結那些發表在同行審閱的期刊中，并使用HCS作為一個主要研究方法的文章，試圖讓大家了解HCS在生命科學的幾個重要領域中的廣泛應用。

可以想見，早期的研究論文著重于把HCS作為一種新技術來發表。當這一技術得到廣泛的接受和使用時，研究的側重點又回到了被研究的生物學問題，而HCS則成為一種工具，為任何新化合物或新假設提供“支持性的生物學證據”。作者認為，這種趨勢是一項新技術被真正采納的標志，也是HCS這項技術被保留下來的有力證明。

有趣的是，雖然大多數使用HCS的論文可歸類為細胞信號通路、腫瘤學、神經生物學、體外毒理學及靶點驗證（例如，RNAi），然而越來越多的新近發表的文章則描述了HCS全新的應用。在上述“標準”應用之外的領域，HCS技術已被廣泛接受，體現了這種技術的靈活性，可以擴展到其它可研究的生物學過程，包括心臟衰竭［1］，間隙連接［2］，免疫抑制［3］，骨質疏松［4］，吞噬作用［5］，自我吞噬作用［6］，中心粒功能［7］，真菌致病機制［8］，視網膜修復［9］，生理節律［10］，以及酵母篩查［11］等等，不一而足。

像其它新技術一樣，HCS也被拿來與當前的技術實驗方法做比較。大多數情況下，HCS相比其它技術手段具有顯著的優勢；或至少被認為是與現有技術互補的，可以提供更多的數據來用于得出科學結論。例如，在最近將HCS與標準酶聯免疫吸附實驗（ELISA）相比較的文章中，可以看到HCS可以從單個細胞的水平來觀察細胞內正在發生的事件，使得測量結果更準確和可靠［12，13］。

Liu等解釋了ELISA和HCS如何提供互補的結果，來幫助作者確定受試化合物的復雜的藥理學原理。文中提到：“很清楚，神經微絲蛋白（NF）的ELISA結果是對神經細胞活性的評估，…… 另一方面，Cellomics ArrayScan HCS平臺，如本研究中所展示的，旨在評估化合物促進神經突觸生長的能力，… …兩種技術平臺結合使用，能夠幫助研究人員鑒定出具有多種 細胞活性的化合物，例如FK506”［14］。

Aglei等引證了使用HCS檢測蛋白／蛋白相互作用的亞細胞水平定位，這是HCS優于第二信使檢測的一個方面。HCS 能夠識別一個細胞培養孔內的某一特定細胞群，使得瞬時轉染 能夠被用于可靠的篩選研究，不再需要強制性地使用穩定轉染 技術，因為基因的過度表達可以導致異常的生理學和毒理學變 化。“HCS實驗提供了其它信息，這些信息不可能從熒光偏振 （FP）和報告基因實驗中獲得，例如蛋白／蛋白相互作用發 生的亞細胞定位。”在這種實驗篩選策略下，與購買FP和報告基因試劑的價格相比，HCS轉位檢測可以稱得上是一種價格低廉的實驗方案[15]。

越來越多的困難實驗正在被HCS所取代，這樣做的好處可能有：比現有方法的靈敏度更高，提高了通量，增加了安全性，和/或降低了成本。Baniecki等人將HCS用于尋找抗瘧新藥，他認為，“使用基于圖像的DAPI惡性瘧原蟲生長實驗， 我們可以檢測到單個瘧原蟲；而使用DAPI惡性瘧原蟲生長實驗和[3H]標記的次黃嘌呤實驗，96孔板上得到的讀數結果顯示為：具有活力的瘧原蟲的比例為0.25%。兩種手段的結果相比較，HCS的靈敏度及可靠性都顯著提高[16]。疾病控制中心的 Johnson等建立了一個快速的高通量牛痘病毒中和實驗[17]， 此方法應用HCS來取代那些“費力的檢測方法，尤其是當待檢樣品數量很多時，需要48-72小時來等待空斑的形成，還需要更多的時間來分析結果，結果很可能帶有很大的主觀性-因為 菌斑是手工計數的。”HCS檢測的是帶有GFP的病毒感染， “因其生成數據的速度和可靠性，具有取代空班減少中和滴度 的可能，而成為臨床實驗室進行中和檢測的標準方法。在正痘病毒爆發事件中，HCS的快速和高通量的特性已證明了它是非常有價值的。

從歷史角度看，HCS源自藥物發現，使用此方法可檢測 多個參數，同時又可檢測單個細胞的特性，因此，該方法起初被用做新型的復篩檢測模式、選擇性篩選和細胞毒性的特征描繪。“高內涵”、“前后關聯”和“具有相關性”等詞語描述了出自于當前的HCS平臺的數據特點[18]，但是，理解這些數據的價值和應用范圍僅在近期的文獻報道中才變得越來越多。 一個非常顯著的例子是，Young等人在他們最近的文章中，將 HCS數據和配體-靶點預測相結合，探討化合物的藥理學機制，非常精彩地表明了應用多層面的HCS數據是如何的強大 [19]。使用細胞周期排列作為模型，收集到了一系列的基于圖 像的細胞學參數。實驗選擇的是帶有36特征的亞集，選定了 六個參數（胞核大小、復制、有絲分裂、胞核形態、EdU紋理 和胞核橢圓度），用于對擁有6547個化合物的庫進行了特征 性描繪。“根據反應參數，有活性的化合物被歸為7個表型效 應的類別中。然后，我們探索了表型特征與活性化合物的結構 之間的關系，并預測了目標化合物的結構特征。這樣所產生的構效關系比僅用單一類型的數據所產生的結果要豐富得多，而 且，我們可以推斷一些化合物的作用機制。”

HCS與細胞信號通路

在藥物研發的過程中，理解環境誘發因素如何觸發一個 特定的生物級聯反應是找到有效治療方法的關鍵。因此，細胞信號通路是開發大多數特異性作用于靶點的藥物的基礎。在科研領域，同樣存在著這樣的需求—研究新發現的蛋白是如何參與到各種各樣的信號通路的。因此，在同行評審的期刊中，常常可以看到引用HCS的文章報道的是細胞信號轉導的某些領域，就不足為奇了。從十年前最初的HCS文章報道NFkB轉位 [20]，許多信號分子的活性已被量化，包括STAT[21,22]， wnd/fzd[23]，akt[24]，NFAT[25]，p38[26]，TGF-beta[27] 和Smad2/3[28,29]，這組成了包括從炎癥反應[30]到G-蛋白 偶聯受體[31-33]的信號通路網絡。

HCS與腫瘤學

通過早期檢測凋亡[34-38]和增殖[39-41]，HCS在腫瘤研究領域找到了最初的立足點。接著，關于細胞周期  [42-44]，轉化[45]和遷移[46-48]的實驗隨之而來。我們開發 了遷移實驗算法和試劑盒，用來評價腫瘤轉移的可能性 [49-51]。利用HCS能夠看到單個細胞的應答，而不是“群體的平均反應性”，這使我們能夠更好地理解抗腫瘤化合物是怎樣對癌變細胞和正常細胞產生不同的作用的，而且，也能夠幫助我們確定腫瘤標志物的功能[52]。使用HCS所鑒定的抗腫瘤化合物已經開始進入臨床實驗階段[53]。

隨著HCS技術的不斷發展，它也逐漸出現在腫瘤研究的其它領域。例如血管生成，現在已經成為一項常規操作，在微孔板中，通過刺激內皮細胞，使其經歷向生成血管的狀態轉化 [54,55]。許多細胞相互傳遞信號，一起協同工作，產生具有特別功能的多細胞結構，這些多細胞結構各自具有不同的特性，分別與不同的疾病狀態相關聯，在這一點上，血管生成做為一個檢測指標是非常令人興奮的。刺激新血管生成，對于受損器官或傷口而言，可能是有利的；而抑制新血管生成，對于實體瘤或視網膜（濕型黃斑部變性）而言，則可能具有治療作用。這里的關鍵是要能夠準確地捕捉、測量和顯示這些表型，這是需要通過對很多參數逐個檢測才能得到的。在血管生成這個例子中，能夠測量血管的大小和形狀、連結度、節點的個數、血管中細胞的個數、甚至血管中細胞的靶點激活情況，可幫助研究者辨別不同的化合物的活性。在腫瘤研究中使用HCS 的另一個熱點領域是：通過定量檢測細胞骨架的重排，特別是微管的組裝和解體，來評價化合物的抗腫瘤作用[56，57]。

NCI化學基因組研究所是充分應用HCS平臺的一個非常好的 例子。他們建立和應用HCS檢測方法進行了核點形成、細胞形態改變以及蛋白轉位的研究。“因為這種檢測結果是在細胞水平完成的，而不是一個板孔內的平均狀況，信噪比非常高；本質上，每一個板孔本身就是一套數據點”[58]。利用HCS，他們鑒定出了新型細胞分裂調節劑以及其它幾種涉及NFAT和FOX01a核轉位的調節因子，這是通過檢測多種細胞運動模式來完成的，而不是像研究經典抗有絲分裂化合物那樣，僅粗略檢測微管的破裂。這里提到的經典的抗有絲分裂化合物，指的是secramine， 它是一種肌動蛋白多聚體的抑制劑，可減少腫瘤轉移。

HCS與神經生物學

在HCS技術發展的最早期，我們就認識到了成像技術在神經細胞形態的量化方面具有非常大的潛力，我們是最早開發出產品來監測神經軸突生長的機構。多年來，根據許多進行神經軸突生長刺激劑[59-62]和神經保護[63-65]研究的用戶的反 饋，我們對算法進行了很多次的優化，使得結果中計算出的指 標在原代細胞和標準細胞系中都能夠代表神經元和神經亞群體的許多特性。

更令人激動的是，不管是對潛在的基本生物學原理的研 究、還是建立新模型、或是為了治療干預而進行的藥物分子篩選，HCS在多種神經疾病狀態的研究中已被廣泛應用。這樣的例子包括Alzheimer氏病[66]，Parkinson氏病[67，68]， Huntington氏病[69,70]，肌萎縮性側索硬化[71]和腦腫瘤 [72]，每年都有更多的文章出現。

HCS與體外毒理學

某種程度上，所有的HCS檢測方法都可以認為是“毒 性”分析，因為這些方法測量的是細胞對刺激的生理學應答，不管這種刺激來自環境還是化學物質。從相對簡單的即刻細胞毒性檢測，例如細胞計數及細胞圓度，到更為特異的細胞器健康狀態的檢測[73，74]，HCS可以應用于多種情形，通常是作為多參數檢測，這種情況下，將多個指標進行交叉關聯分析，會幫助深入確定毒性狀態。

很清楚，HCS已經在藥物研發中細胞毒性分析領域確立 了堅實的地位[75]。然而，超越于直接檢測細胞毒作用的應用領域，即能夠做到在細胞水平進行預測，來評估對于整個生物 體（例如我們人類）產生的下游毒性效應，這才是藥物發現中自動化成像領域的重要發展方向，因為能否在正確的時間獲取 關鍵的數據，這種能力的不斷增強就意味著上億美元的得失。 最初的應用領域包括：采用微核誘導檢測[77，78]來評估基因毒性，檢測肝脂肪沉積來評估是否患有磷脂質病[79]，以及發育神經毒性[80]。展望未來，HCS技術在建立新型的毒性分析模型[81]，包括使用模式生物如斑馬魚和線蟲方面，還具有很大的潛力。

一個最令人興奮的結果證明了多參數成像方法對于體外毒性學研究在藥物誘導的肝損傷領域中的潛力。這里，Xu等 對一系列的與肝毒性直接相關的表型建立了一個檢測方案 [82]。“在檢測300多種藥物和化合物（其中包括許多可以導 致人類中罕見的肝毒性藥物）時，使用我們的檢測方案，檢出率達到50-60%，假陽性率非常低，僅為0-5%”。

在另一個肝毒性化合物的追溯調查中，O’Brien等[83]將 業內廣泛使用的“標準7項”生化細胞毒性分析方法與一種4 通道多參數的HCS分析方法進行了比較。結果表明，與“標準 7項”生化分析中最佳組合項目相比較，HCS具有更高的靈敏 度（93%比<25%）和特異性（98%比~90%）。這些研究成果在制藥產業界得到了廣泛證實[84]。

HCS與靶點驗證

藥物發現早期的靶點驗證，以及大多數基礎研究，都著眼于尋找細胞生物學架構中的新成員，以及驗證它們各種各樣的功能。在基礎研究方面，靶點驗證可以幫助理解細胞生物學 的全景；在藥物發現方面，靶點驗證為開發反應疾病狀態的檢 測分析方法提供了基礎，從而可以找到阻止疾病狀態的分子。 最終，這個領域的成功與否取決于相關性高的生物學模型及準確的生理環境條件。相對較晚出現的技術是利用干細胞和 RNAi來產生細胞模型，這是一個對表型進行量化檢測的絕佳 手段。不管是追蹤一個正在分化的干細胞變成肌細胞群的發展過程，還是評估敲除神經軸突細胞生長的增殖信號的結果， HCS都可應用于其中。在最近的發表一篇基于RNAi篩選的綜 述中，Perrimon評論到，“在RNAi  HTS中也許最顯著的進展 將會來自高內涵篩選。依賴細胞表型的HCS檢測在RNAi  HTS 中正在成為一種首選的方法，因為它們產生的數據集信息豐富，原代細胞的使用提供了很多機會，能夠在生物相關性比較高的環境下，對細胞形態進行篩選”［85］。

Moffat等建立了一種基于高內涵成像的篩選方法，來鑒定有絲分裂進程中所必須的基因，并針對5000種表達獨特 shRNA、以1028個人類基因為靶點的慢病毒載體進行了篩選 ［86］。這個篩選找到了大約100個（新型）增殖相關的候選 調控元件。類似的利用HCS篩選siRNA文庫來監測表型參數的 研究項目也已經完成［87－90］。

在干細胞研究的前沿，HCS已被用于幫助鑒定與干細胞自我更新［91，92］和分化［93］相關的調節系統，主要是通過胚胎干細胞［94，95］或從成年人組織衍生出的細胞系 ［96］中的多能性標記物（例如，Oct-4）進行量化檢測。通過使用多種分化狀態的生物標記物，已經完成了對細胞命運的下游追蹤［97］。 Peerani等闡明了HCS具有可以提供細胞與細胞的空間關系的獨特能力，該研究揭示了人胚胎干細胞 （hESC）培養體系的異質微環境（小生態環境）對hESC的命 運產生了影響［98］。將細胞分化的誘導和抑制因子（通過 siRNA下調）的分泌局限化以后，通過檢測niche的大小和細 胞組成，“我們率先發現了Smad1在空間信息整合、以及 niche大小相關的hESC自我更新和分化中的控制作用。”

表1.HCS主要的應用領域及參考文獻舉例

未來的方向及展望

從上述引用的文獻中，可以清楚地看到HCS已經超越了“證明自身技術”的階段，而正在進入“被廣泛采用”的階段，隨著用戶需求的不斷增加，將推動這項技術變得更加節約成本、更易于使用，并且更加可靠。新試劑［99］和微環境的開發，與自發熒光蛋白的持續應用［100］一起，將打開一扇通往更多量化檢測細胞行為的大門。著眼于HCS的生產力指標，產生信息（分析前處理自動化，試劑盒，算法）和理解這些信息（數據管理，數據可視化，數據挖掘）兩方面都將成為對檢測平臺的重要補充，使得HCS產生的常規數據成為生命科學研究中支持決策的一部分證據。隨著HCS從原來的主要應用范圍向大規模使用演化，技術開發將通過使用多細胞集群、組織、器官和有機體向加強生物數據相關性邁進。另一個趨勢是：將細胞組學與基因組學、蛋白組學技術結合起來，將會提供一個前所未有的細胞功能的藍圖。

由于許多國家正在提議減少動物實驗，因此，在不遠的將來，HCS的前景是非常光明的[101,102]。現在，正是開發細胞分析工具（諸如HCS）的最佳時機。作為一個從一開始就參與開發此技術的人員，我可以誠實地說，由于一些“高產出用戶”的熱情和貢獻，HCS作為一個強大的工具，正在貢獻它的力量，幫助構建未來的“科學知識架構”。

注：

今天，細胞組學（Cellomics）被認為是定量細胞分析的一門學科，也稱為高內涵篩選（HCS）或高內涵分析（HCA）。HCA包括熒光顯微鏡，圖像處理，自動細胞測量和信息學工具的強大組合，使生物學研究的基本發現成為可能。1996年，Cellomics Inc.在美國賓夕法尼亞州匹茲堡成立，旨在利用卡內基 - 梅隆大學的技術，生產用于藥物發現應用的儀器，軟件和試劑，Cellomics目前是賽默飛世爾科技的一部分，在全球已使用了數百臺儀器，并發表了近1000份同行評審的出版物。

Thermo公司高內涵技術應用.pdf