高脂血癥大鼠種植體早期骨結合界面的微觀分析

目的研究高脂血癥大鼠種植體早期骨結合界面的微觀形態和微觀成分,并探究其與Dishevelled-2 (DVL2)相關的可能的分子機制。方法(1).Wistar大鼠60只,均為雄性,依照隨機原則,分為實驗組和對照組分別以高脂飼料和普通飼料喂養。(2).12周后,檢測實驗組大鼠血脂水平,去除實驗組中不符合高脂血癥標準的大鼠以及對照組中血脂異常的大鼠。在全麻下分別將一枚種植體植入,兩組大鼠左右兩側股骨干骺端。在種植體植入后的1天、3天和5天分別處死一批大鼠,取出含有種植體的骨組織(圖1),分別進行不同的檢測。(3).種植體植入后1天和5天的標本固定包埋后制作硬組織切片,分別進行光學顯微鏡和和掃描電鏡(scanning electronic microscopy, SEM)觀測,分析種植體早期骨結合界面的微觀形態的動態變化。光學顯微鏡觀測種植體周圍的成骨細胞、破骨細胞和骨小梁；SEM進一步在高倍鏡下,觀測種植體周圍的成骨細胞、破骨細胞和骨質狀況。(4).種植體植入后1天和5天的標本固定包埋后制作硬組織切片,在種植體中部1/3,沿種植體向組織方向,以10 um為間隔依次選“1-6”六個微區(圖2),通過X射線能譜儀(energy dispersive X-ray spectrometer, EDS)分析種植體早期骨結合界面的微觀成分的動態變化,進行鈣、磷、氧和鈦元素定量測定；計算Ca/P原子個數百分比。(5).1天、3天和5天的標本,一部分液氮凍存通過熒光定量PCR (relative fluorescence quantitative polymerase chain-reaction, RT-PCR)檢測種植體周圍1mm骨組織中DVL2基因的表達情況；另外一部分,迅速提取蛋白,通過Western Bolt檢測種植體周圍1mm骨組織中DVL2蛋白和磷酸化的DVL2蛋白的表達情況。結果(1).光學顯微鏡分析發現,種植體植入后的1-5 d,種植體周圍的成骨細胞和破骨細胞逐漸增多。實驗組骨質疏松,骨小梁稀疏、排列紊亂；對照組骨質致密。實驗組種植體周圍的成骨細胞少于對照組(P<0.05),破骨細胞多于對照組(P<0.05)。(2).SEM觀測到的結果與光學顯微鏡相似,在種植體植入后的1-5 d,種植體周圍的成骨細胞和破骨細胞逐漸增多。實驗組骨質疏松,對照組骨質致密。實驗組種植體周圍的成骨細胞少于對照組,破骨細胞多于對照組。(3).實驗組Ca/P原子個數百分比低于對照組(P<0.05),O元素的原子百分比高于對照組(P<0.05)；由種植體至骨組織Ti元素的原子百分比逐漸減少,實驗組和對照組各取樣微區內的Ti元素原子百分比無明顯差異。實驗組和對照組的“5、6”取樣微區的Ca/P原子個數百分比,均隨時間的增加而減少,并且“5”取樣微區的Ca/P原子個數百分比略小于“6”取樣微區的Ca/P原子個數百分比；“4”取樣微區的Ca/P原子個數百分比,隨種植體植入時間的增加而略增加。“1、2、3”取樣微區均未檢測到Ca、P元素。實驗組和對照組的“5、6”取樣微區的O元素原子百分比,隨種植體植入時間的增加而略增加,并且“5”取樣微區的O元素原子百分比大于“6”取樣微區的O元素原子百分比；“4”取樣微區的O元素原子百分比,隨種植體植入時間的增加而略微減少。“1、2、3”取樣微區均未檢測到O元素。實驗組和對照組的“6”取樣微區未檢測到Ti元素,“1、2、3、4、5”取樣微區的Ti元素原子百分比逐漸減少,“4、5”取樣微區的Ti元素原子百分比,表現出隨種植體植入時間的增加而稍減少的趨勢；“1、2、3”取樣微區的Ti元素原子百分比,隨種植體植入時間的增加而略增加。(4).實驗組的DVL2基因的表達水平不及對照組(P<0.05)。實驗組DVL2的mRNA的表達水平在1-3天呈現下降趨勢,在3-5天內呈現出上升趨勢(p<0.05)；對照組DVL2的mRNA的表達水平在1-3天以內略微上升,在3-5天內略微下降。(5).DVL2蛋白的表達水平與DVL2的mRNA的表達水平相似。實驗組的DVL2蛋白的表達水平低于對照組(P<0.05)。實驗組DVL2蛋白的表達水平在1-3天呈現下降趨勢,在3-5天內呈現出上升趨勢(p<0.05)；對照組DVL2蛋白的表達水平在1-3天以內呈現上升趨勢,在3-5天內略微下降。(6).實驗組的磷酸化的DVL2蛋白的表達水平低于對照組(P<0.05)。實驗組磷酸化的DVL2蛋白的表達水平在1-3天呈現下降趨勢,在3-5天內呈現出上升趨勢(p<0.05)；對照組磷酸化的DVL2蛋白的表達水平在1-3天以內也呈現下降趨勢,之后基本維持在恒定的水平。結論高脂血癥通過抑制DVL2基因、DVL2蛋白和磷酸化的DVL2蛋白的表達,在一定程度上干擾種植體的早期骨結合。此研究為提高高脂血癥患者種植的成功率提供了理論支持。